IL-18及IL-18结合蛋白在人正常月经周期子宫内膜的表达

罗金，刘雪丽，王雅琴，杨菁，徐望明

(武汉大学人民医院生殖医学中心，武汉　430060)



IL-18及IL-18结合蛋白在人正常月经周期子宫内膜的表达

罗金，刘雪丽，王雅琴，杨菁*，徐望明

(武汉大学人民医院生殖医学中心，武汉430060)

【摘要】目的探讨白细胞介素(IL)18及IL18结合蛋白(IL18BP)在人正常月经周期子宫内膜上的表达。方法取因子宫肌瘤或子宫脱垂行全子宫切除术的患者子宫内膜，按月经周期和子宫内膜形态学检查结果分为增生期和分泌期2组，每组10例。免疫组织化学法检测子宫内膜的IL-18及IL-18 BP表达；实时定量聚合酶连锁反应(qRT-PCR)检测子宫内膜IL-18及IL-18BP mRNA的表达。结果IL-18、IL-18BP在人增生期和分泌期子宫内膜中均有表达，且随着月经周期其表达呈现时空性变化。IL18在增生期表达于腔上皮、腺上皮细胞膜及基质细胞，与增生期相比，分泌期基质细胞IL18的阳性表达显著降低(MOD值0.33±0.07 vs. 0.52±0.12，P<0.05)，而IL18BP的表达则显著增加(MOD值0.33±0.20 vs. 0.10±0.07，P<0.05)。qRT-PCR 结果显示，在增生期和分泌期子宫内膜标本均有IL18和IL18BP mRNA表达，与增生期相比，分泌期IL18表达显著下降(P<0.05)，IL18BP表达显著增强 (P<0.05)，IL18BP/IL18比值显著增高(P<0.05)。结论IL18和IL18BP在整个月经周期人子宫内膜上均有表达，且其表达呈现时空性的变化，可能与月经周期过程中子宫内膜的崩解修复有关。

【关键词】白细胞介素18；白细胞介素18结合蛋白；子宫内膜；表达

(JReprodMed2016，25(3)：248-252)

子宫内膜对胚胎的容受性和胚泡与子宫内膜的同步发育是妊娠建立的关键因素之一，而子宫的免疫耐受机制又是影响胚泡植入的关键。越来越多的证据表明，胚胎着床过程中母胎界面的生长因子和细胞因子起着至关重要的作用[1]，这些细胞因子异常表达或作用的紊乱将可能引起胚胎植入失败或异常胎盘形成[2]，而子宫内膜则是一个产生细胞因子并使之活化的重要位点[3]。白细胞介素(IL)-18是白介素家族的一个新成员，研究表明[3-5]，人、小鼠子宫内膜内均有IL-18表达，胚胎植入后期鼠子宫IL-18的表达显著高于植入前期，且妊娠期子宫IL-18的表达较非妊娠显著增加，并随着妊娠进行，IL18表达逐渐增强，提示IL18可能对胚胎的植入、建立及维持正常妊娠具有非常重要的作用。而人IL-18结合蛋白(IL18-BP)是一种能与IL-18高亲和力特异性结合的蛋白因子，它通过与IL-18竞争结合而阻止IL-18与其受体结合，从而有效地抑制IL-18的生物学活性，视为IL-18的拮抗剂[6]。本研究对人正常月经周期不同时期子宫内膜上IL-18和IL18-BP的表达情况进行分析，探讨其在人子宫内膜上的表达变化规律，为进一步探讨IL-18在子宫内膜周期变化中的作用及调节机制奠定基础。

材料和方法

一、材料

1.临床资料：选取2014年9月至2015年3月因子宫肌瘤或子宫脱垂在本院行全子宫切除术的患者子宫内膜共20例，根据患者月经周期和病理检查结果将子宫内膜标本分为增生期和分泌期两组，每组10例。增生期组患者年龄32～40岁，平均年龄36.8±2.70岁，分泌期组患者年龄33～41岁，平均年龄36.5±2.72岁。所有患者既往月经周期规律、无盆腔炎、生殖道感染和子宫内膜异位症及其他自身免疫性疾病等病史，近3月内未使用激素治疗。本研究获得本院伦理委员会同意及所有患者的知情同意。

2.标本采集：术中取新鲜子宫，刮取子宫内膜组织，用生理盐水漂洗干净后，将每份子宫内膜标本分成两部分，一部分迅速放入液氮中，约0.5 h后转移至超低温冰箱-70 ℃保存；另一部分置于4%多聚甲醛中固定24 h后行石蜡切片。

3.试剂：Trizol购自Invitrogen公司，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒购自Fermentas公司，One Step SYBR PrimeScripTM RT-PCR Kit购自日本Takara公司，IL 18、IL18 BP引物由上海生工生物工程有限公司合成，免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司，鼠抗人单克隆IL18抗体购自台湾abnova公司，兔抗人单克隆IL18BP抗体购自英国abcam公司，二抗试剂盒购自丹麦DAKO公司。

二、方法

1.免疫组织化学检测：(1)标本处理：将子宫内膜组织于4%多聚甲醛中固定24 h后，入系列乙醇脱水、透明、石蜡包埋，厚度4 μm切片。切片在温水上展平，移至涂有10%多聚赖氨酸的玻片上，放入烤箱内烤干，备用。(2)免疫组织化学染色：切片脱蜡至水，滴加3%过氧化氢溶液37℃封闭10 min 灭活内源性过氧化物酶，PBS缓冲液冲洗3次后，将玻片放入盛有柠檬酸盐缓冲液的容器中微波修复，室温下放置至自然冷却后取出切片蒸馏水洗后，TBS缓冲液冲洗5 min×3次，蒸馏水5 min洗一次，除去TBS。每张切片滴加50 μl 10%山羊血清，37 ℃下孵育20 min，甩干。每张切片滴加约50 μl IL-18或IL18-BP一抗(稀释倍数分别为：IL18 1∶40；IL18-BP 1∶50)，4℃过夜。TBS冲洗5 min×3次。每张切片滴加50 μl DAKO二抗(兔抗鼠)，室温孵育20 min，TBS冲洗5 min×3次。甩去TBS，每张切片加50 μl新鲜配置的 DAKO DAB溶液镜下观察。流水洗15～20 min，苏木素复染2 min，自来水冲洗后，1%盐酸酒精分化1～2 s。自来水冲洗15 min以上，温水返蓝。切片放置梯度酒精脱水干燥，每步约2 min，二甲苯透明，中性树胶封片镜检。以正常山羊血清代替一抗作为阴性对照。选取同批染色切片，每张切片在光镜下随机取5 个不同视野，经Image-Pro Plus 6.0 病理图片分析系统分析，测定阳性信号的光密度值(OD)。

2.实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测：(1)总RNA提取：将子宫内膜标本从-70 ℃冰箱中取出，研磨成粉末，加入1 ml Trizol，用力研磨成液体后移入二乙基焦炭酸酯(DEPC)水处理过的1.5 ml 微量离心管(EP)中，按照说明书裂解细胞，提取总RNA，1%琼脂糖电泳检测总RNA的完整性，紫外分光仪测定RNA的纯度及产量。(2)qRT-PCR扩增：采用One Step SYBR PrimeScriptTMRT-PCR 试剂盒扩增IL18、IL18BP的序列。引物序列及片段见表1。PCR反应体系总体积25 μl，其中2×One Step SYBR RI-PCR Buffer 12.5 μl，Ex Taq HS 0.5 μl引物 1 μl(上下游各0.5 μl)，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ0.5 μl，Total RNA temples 2 μl，RNase Free dH2O 8.5 μl。设置反应条件为：Pattern1：反转录反应 42℃ 5 min，95℃ 10 s；Pattern2：PCR反应，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40 个循环；收集荧光信号。每1 个样本做 3 个平行管。基因表达的相对变化采用2-△△Ct法处理。

表1　各基因 real-time PCR 引物序列及片段

三、统计学方法

结果

一、免疫组织化学法检测IL18、IL18BP在人子宫内膜中的表达结果

如图1所示，IL-18、IL-18BP在人增生期和分泌期子宫内膜中均有表达，IL18在增生期主要表达于腔上皮、腺上皮细胞膜及基质细胞，分泌期则可见基质细胞IL18表达明显减少，IL18BP在分泌期基质细胞表达增多。棕色反应产物表示为抗体染色阳性反应。采用Image-Pro Plus 6.0 病理图片分析系统对IL18、IL-18BP的表达进行定量分析，结果显示与增生期相比，分泌期IL18的阳性表达明显降低(MOD值0.33±0.07vs.0.52±0.12)，(P<0.05)，而IL18BP的表达则显著增加(MOD值0.33±0.20vs. 0.10±0.07)，(P<0.05)(图2)。

二、qRT-PCR检测子宫内膜中IL18、IL18BP的mRNA表达水平

qRT-PCR 结果显示，在增生期和分泌期子宫内膜标本均有IL18和IL18BP mRNA表达。与增生期相比，分泌期IL18 mRNA表达下降(P<0.05)，IL18BP mRNA表达增强(P<0.05)，IL18BP/IL18比值显著增高(P<0.05)(图3)。

讨论

本研究中，分别从mRNA和蛋白水平检测了IL18和IL18BP在人月经周期不同时期子宫内膜上的表达，结果显示与子宫内膜上其他的一些促炎性细胞因子如IL-1，IL-8，IL-15等表达相一致[3]，IL18和IL18BP在增生期和分泌期人子宫内膜上均有表达。由此推测IL18信号系统可能与其他一些促炎性因子共同参与了人子宫内膜免疫微环境的调节。

IL-18是1995年由Okamura等[7]首次分离出的一种多功能细胞因子，主要由活化的单核细胞、巨噬细胞和树突细胞产生，其结构与IL-l相似，功能与IL-12相似，具有多种生物学活性，最显著的特性是对T细胞的调节，尤其是THl细胞和自然杀伤(NK)细胞的活性调节，在炎症级联反应中具有中心地位，对机体的免疫和炎症反应有非常重要的调节作用。多项研究已经证实[8-10]，Th1/Th2型细胞因子的平衡对正常妊娠的维持有着非常重要的作用，而IL-18是一个能够根据免疫微环境变化，促进Thl和Th2型细胞分化的细胞因子。IL18通过与其受体相结合，发挥促炎效应[11]，而IL-18BP能够以高亲合力特异性地与IL-18相结合，抑制IL-18相关的生物学活性，如抑制IL-18诱导Th1等细胞产生干扰素(IFN-γ)、IL-8，降低IL-18对NF-κB的激活作用，以早期Thl细胞因子抑制剂的形式参与Thl应答的调控。与IL18不同的是，IL18BP不具有种族特异性。一个健康人循环中的IL18BP浓度为(2.15±0.15) ng/ml (range 0.5～7)[12]。一般情况下，IL18BP的摩尔量是IL18的20～30倍，因此，可以认为IL-18BP是一种与IL18升高有关的免疫或炎性疾病的有效抑制剂[3]。在本研究中，发现在分泌期子宫内膜基质和腺体中IL-18 BP染色表达明显增强，且与增生期相比，分泌期IL-18BP/IL-18 mRNA的比值显著增大，结果提示人子宫内膜分泌期 IL-18BP的表达增加可能在调节IL-18的活性过程中发挥作用。

A：增生期子宫内膜IL18的表达；B：分泌期子宫内膜IL18的表达；C：阳性对照，肝脏组织中IL18的表达；D：增生期子宫内膜IL18BP的表达；E：分泌期子宫内膜IL18BP的表达；F：阴性对照。LE：腔上皮；GE：腺上皮；S：基质图1　IL18及IL18BP在人子宫内膜中的表达 免疫组织化学染色　×200

与增生期相比较，*P<0.05A：IL-18的蛋白表达水平；B：IL18BP 的蛋白表达水平图2　IL18及IL18BP在子宫内膜不同时期的蛋白表达水平

与增生期相比较，*P<0.05A：IL18 mRNA相对表达量；B：IL18BP mRNA相对表达量；C：IL18BP/IL18比值图3　子宫内膜中IL18、IL18BP的mRNA表达情况

此外，本研究免疫组化结果显示 IL-18和IL18-BP在人子宫内膜上的表达随着月经周期呈现时空性变化，IL-18在增生期主要表达于腔上皮、腺上皮细胞膜及基质细胞，分泌期则可见基质细胞IL-18表达明显减少，IL18-BP在分泌期基质细胞表达增多。qRT-PCR结果则进一步显示与增生期子宫内膜相比，分泌期子宫内膜IL-18 mRNA表达显著降低，而IL18-BP mRNA表达显著增高，提示IL-18信号系统可能参与了人月经周期过程中子宫内膜的崩解与修复过程。另有研究表明[5]，IL-18是参与胚胎植入的重要细胞因子，在胎儿母体界面的特定组织中呈阶段依赖性分布，在胚胎植入过程，缺乏或过度激活IL-18都会引起胚胎植入失败。IL-18还可能与子宫螺旋动脉的形态变化有关，调节子宫局部血管的转化，在胚胎成功植入过程起关键作用。Ledee-Bataille等[13]研究发现，根据子宫腔内分泌物中IL-18的含量可以预测胚胎植入的成败，IL-18阴性组患者妊娠率和胚胎着床率均显著高于IL-18阳性组。此外，多项研究显示[14-15]，自然流产患者血清或母胎界面IL-18表达水平较正常妊娠患者显著升高。这些结果表明IL-18信号系统还可能参与了胚泡植入过程，并在妊娠过程中起着重要的作用。

综上所述，IL-18和IL18-BP为子宫内膜分泌的局部免疫调节因子，在整个月经周期人子宫内膜上均有表达，可能参与了人月经周期过程中子宫内膜的崩解与修复过程及胚胎着床过程中的免疫调节，但其具体调节机制还有待进一步研究。

【参考文献】

[1]Chaouat G，Ledee-Bataille N，Chea K，et al. Cytokines and implantation[J]. Chem Immunol Allergy，2005，88：34-63.

[2]王洪，张学勤. 白细胞介素18在妊娠中的作用及相关病理妊娠[J]. 医学综述，2015，16：1453-1456.

[3]Huang HY，Chan SH，Yu HT，et al. Interleukin-18 syste messenger RNA and protein expression in human endometrium during the menstrual cycle[J]. Fertil Steril，2006，86：905-913.

[4]Murakami Y，Otsuki M，Kusumoto K，et al. Estrogen inhibits interleulin-18 mRNA expression in the mouse uterus[J]. J Reprod Dev, 2005,51：639-647.

[5]张艳，李文献，陈树林.白细胞介素-18在大鼠胚泡植人前后子宫的分布及表达[J].解剖学报，2008，39：98-101.

[6]AbdμL-Sater AA，Said-Sadier N，Ojcius DM，et al. Expressions of IL-18 and its binding protein in peripheral blood leukocytes and kidney tissues of lupus nephritis patients[J].Drugs Today(Bare)，2009，45 (Suppl B)：105-112.

[7]Okamura H，Tsutsi H，Komatsu T，et al. Cloning of a new cytokine that induces IFN-gamma production by T cells[J]. Nature，1995，378：88-91.

[8]Rezaei A，Dabbagh A. T-helper(1)cytokines increase during early pregnancy in women with a history of recurrent apontaneous abortion[J]. Med Sci Monit，2002，8：607-610.

[9]Kwak-Kim JY，Chung-Bang HS，Ng SC，et al. Increased T helper 1 cytokine responses by circulating T cells are present in women with recurrent pregnancy losses and in infertile women with multiple implantation failures after IVF [J]. Hum Reprod，2003，18：767-773.

[10]Yokoo T，Takakuwa K，Ooki I，et al. Alteration of TH1 and TH2 cells by intracellular cytokine detection in patients with unexplained recurrent abortion before and after immunotherapy with the husband’s mononuclear cells[J]. Fertil Steril，2006，85：1452-1458.

[11]Lebel-Binay S，Berger A，Zinzindohoue F，et al. Interleukin-18：biological properties and clinical implication[J]. Eur Cytokine Netw，2000，11：15-26.

[12]Fantuzzi G，Puren AJ，Harding MW，et al. Interleukin-18 regulation of interferon gamma production and cell proliferation as shown in interleukin-1beta-converting enzyme (caspase-1)-deficient mice[J]. Blood，1998，91：2118-2125.

[13]Lédée-Bataille N，Olivennes F，Kadoch J，et al. Detectable levels of interleukin-18 in uterine luminal secretions at oocyte retrieval predict failure of the embryo transfer[J]. Hum Reprod，2004，19：1968-1973.

[14]孙燕，苏琳，陈佩，等. 复发性流产患者绒毛组织中白细胞介素-6和白细胞介素-8的表达[J]. 广东医学，2012，33：1563-1566.

[15]李静，杨雪峰. IL-18在复发性流产患者蜕膜和绒毛组织中的表达[J]. 医药论坛杂志，2008，29：8-9.

[编辑：辛玲]

Expression of IL-18 and IL-18 binding protein in normal human endometrium during menstrual cycle

LUOJin，LIUXue-li，WANGYa-qin，YANGJing*，XUWang-ming

ReproductiveMedicalCenter，RenminHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430060

【Abstract】

Objective： To detect the expression of IL-18 and IL-18 binding protein (IL18BP) in normal human endometrium during menstrual cycle.

Methods： A total of 20 human endometria samples were obtained from the women with normal cycle undergone hysterectomy (10/group). The endometria samples were divided to the proliferative and secretory phase group (ten for each) according the phase of cycle and morphologic examination results. The expressions of IL-18 and IL18BP were detected by immunohistochemistry and qRT-PCR respectively.

Results： IL-18 and IL-18BP were expressed in both of proliferative and secretory phase of endometrium，and the expression showed temporal changes with the menstrual cycle. IL18 mainly expressed in luminal epithelium，glandular epithelium and stromal cell membrane in the proliferative phase. Compared with the proliferative phase group，the expression of IL18 in the stromal cells was significantly reduced (MOD 0.33±0.07 vs.0.52±0.12，P<0.05)，but the expression of IL-18 BP was significantly increased in the secretory phase group (MOD 0.33±0.20 vs.0.10±0.07，P<0.05). qRT-PCR results showed that the expression of IL-18 mRNA was significantly decreased (P<0.05)，and IL-18BP was significantly increased (P<0.05) in human endometrium in secretory phase compared with proliferative phase. The ratio of IL-18BP/IL-18 was significantly increased (P<0.05).

Conclusions： IL-18 and IL-18 BP were expressed in human endometrium throughout the menstrual cycle with temporal change. They may be involved in the disintegration and repair of endometrial during the menstrual cycle.

Key words：IL18；IL18 binding protein (IL18BP)；Endometrium；Expression

【作者简介】罗金，女，湖北天门人，博士，生殖医学专业.(*通讯作者,Email：dryangqing@hotmail.com)

【基金项目】中央高校基本科研业务费专项(No：2042015kf0137)

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.3.010

【投稿日期】2015-09-01；【修回日期】2015-11-11