缺血预处理对大鼠脑组织及血清氨基酸水平的影响

王小琴，邹玉安，薛茜,田莉，魏孟琳

(1河北北方学院，河北张家口075000；2河北北方学院附属第一医院)



缺血预处理对大鼠脑组织及血清氨基酸水平的影响

王小琴1，邹玉安2，薛茜2,田莉1，魏孟琳1

(1河北北方学院，河北张家口075000；2河北北方学院附属第一医院)

摘要：目的观察缺血预处理(CIP)对大鼠脑组织及血清天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)水平的影响。方法 将90只SD大鼠随机分为3组各30只,A组短暂性阻断双侧颈总动脉行CIP处理， B组不阻断血流,C组不处理。CIP后1、3、6、12、24 h，采用高效液相色谱法检测脑组织及血清中的Glu、Asp、GABA、Gly。结果与B、C组同时点比较，A组脑组织与血清中Glu、Asp、GABA、Gly均增高(P均<0.05或0.01), 1 h或3 h达高峰，3 h或6 h后开始逐渐下降, 24 h恢复正常水平。结论 CIP后大鼠脑组织及血清Glu、Asp、Gly、GABA升高，这可能是早期脑缺血耐受机制的启动因素。

关键词：脑缺血；预处理；天冬氨酸；谷氨酸；γ-氨基丁酸；甘氨酸

缺血预处理(CIP)是预先给予大脑一次或多次短暂的、亚致死性的缺血，诱导机体产生内源性保护机制从而对抗随后更严重的缺血损伤[1]，但其具体机制仍未阐明。以往研究发现，兴奋性氨基酸在脑缺血再灌注损伤中起重要作用[2]。2014年9月～2015年8月，我们观察了CIP对大鼠脑组织及血清天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)水平的影响，为缺血缺氧性脑病的防治提供依据。

1材料与方法

1.1材料成年雄性SD大鼠90只，SPF/UAF级，体质量(250±10)g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。e2695 高效液相色谱仪(美国Waters公司)，HypersilC18色谱柱(美国Thermo公司)，2,4-二硝基氟苯(DNFB，成都格雷西亚化学技术有限公司)，4种氨基酸标准品(纯度均>98%，上海源叶生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1动物分组与处理90只大鼠禁食但自由饮水24 h，随机分为3组各30只。A组水合氯醛350 mg/kg麻醉，仰卧位固定，根据改良两血管闭塞(2VO)法[3]行CIP处理，即短暂性阻断双侧颈总动脉；B组处理同A组，但不阻断血流；C组不处理。

1.2.2标本获取CIP后1、3、6、12、24 h每组各取6只，腹腔注射麻醉后迅速腹主动脉取血3 mL，低温离心15 min后取上清，-80 ℃冰箱备用。同时迅速冰盘上断头取脑，称重，加入9倍量的0～4 ℃生理盐水；在冰水浴上机械匀浆得10%脑组织匀浆，低温离心取上清，-80 ℃冰箱备用。

1.2.3脑组织及血清氨基酸测定采用高效液相色谱法。色谱条件：流动相A为甲醇，流动相B为0.015 mol/L醋酸钠缓冲液(pH 6.0), 0.45 μm滤膜过滤，超声脱气20 min；流速1 mL/min，检测波长360 nm，柱温30 ℃；进样10 μL进行梯度洗脱，采用外标法定量分析。

取出标本后复溶，低温高速离心，取上清液400 μL；加入乙腈400 μL，漩涡混匀1 min，低温12 000 r/min离心10 min去除蛋白；取上清液加入0.5 mol/L碳酸氢钠400 μL和 0.5% DNFB 200 μL，漩涡混匀，55 ℃下暗中衍生60 min，进样10 μL[4]。

2结果

CIP后不同时点各组大鼠脑组织及血清中氨基酸水平比较，见表1。

3讨论

研究发现，随脑缺血再灌注损伤加重，脑内兴奋性氨基酸(Glu、Asp、Gly)水平会逐渐升高甚至达基

表1　CIP后不同时点各组大鼠脑组织及血清中氨基酸水平比较±s)

注：与B、C组同时点比较,*P<0.05，△P<0.01。础水平的数十倍，而相应的脑梗死体积逐渐增大,即兴奋性氨基酸的毒性呈现剂量依赖性[5]。

本实验结果发现，CIP后A组大鼠血清及脑组织中4种氨基酸均升高，以兴奋性氨基酸升高最显著。表明采用温和的脑缺血方式，不但不会引起神经元的严重损伤,还可以诱导机体产生内源性的保护机制。当下次更严重的缺血缺氧损伤到来时，虽然兴奋性氨基酸大量增加，但机体内源性的保护机制已被调动。例如，CIP后增加的Glu可能促使兴奋性氨基酸向抑制性氨基酸转化[2]，激活星型胶质细胞，可上调Glu转运体表达[6，7]、下调Glu受体(NMDA、AMPA),抑制Glu释放等来降低其兴奋毒性；此外，Glu还可以促进谷胱甘肽合成，产生抗氧化应激作用等[8，9]。这与 Badawi等[10]的研究结果一致。CIP后增加的Gly可以使神经细胞膜超极化，进而抑制NMDA受体通道开放，降低Gly对神经元的兴奋毒性[11，12]。因此，CIP后大鼠脑组织及血清中氨基酸水平升高，可能是早期脑缺血耐受的启动因素。

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[9] Li L, Zuo Z.Glutamate transporter type 3 knockout reduces brain tlerance to focal brain ischemia in mice[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2011,31(5):1283-1292.

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[11] 王国华,姜正林,李霞,等.甘氨酸受体激动剂对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的神经保护作用[J].临床神经病学杂志,2010,23(1):38-41.

[12] Chen Z, Hu B, Wang FZ, et al. Glycine bidirectionally regulates ischemic tolerance via different mechanisms including NR2A dependent CREB phosphorylation[J]. J Neurochem, 2015,133(3):397-408.

(收稿日期：2015-10-09)

中图分类号：R332

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)10-0031-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.10.012

通信作者：邹玉安(E-mail： zya8857111@sohu.com)

基金项目：河北省医学科学研究重点课题计划项目(20090591)。