不同剂量培哚普利对缺血性心功能障碍家兔心功能及ACE2/Ang-(1-9)/Ang-(1-7)轴的影响

郝　潇，　李树仁，　孟田田，　高　青，　党　懿，　荀丽颖，　苑可心，　张倩辉，　郝清卿，　齐晓勇

(河北医科大学附属河北省人民医院心脏一科，河北 石家庄 050051)



不同剂量培哚普利对缺血性心功能障碍家兔心功能及ACE2/Ang-(1-9)/Ang-(1-7)轴的影响

郝潇，李树仁△，孟田田，高青，党懿，荀丽颖，苑可心，张倩辉，郝清卿，齐晓勇

(河北医科大学附属河北省人民医院心脏一科，河北 石家庄 050051)

[摘要]目的： 探讨不同剂量培哚普利对缺血性心功能障碍家兔心功能的影响。方法：采用结扎冠状动脉前降支的方法制作缺血性心功能障碍家兔模型。利用随机数字表法将30只家兔随机分为培哚普利大、小剂量组和心功能障碍组。大、小剂量组分别给予培哚普利生理盐水溶液(浓度分别为1 g/L、0.33 g/L)2 mL·kg-1·d-1灌胃；心功能障碍组给予等量生理盐水灌胃。4周后心脏超声测定心功能；real-time PCR检测血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)和血管紧张素2型受体(angiotensin type 2 receptor，AT2R) mRNA表达；ELISA检测家兔血清血管紧张素(angiotensin,Ang)-(1-9)和Ang-(1-7)水平。结果：与心功能障碍组相比，不同剂量培哚普利均可改善心功能(P<0.01)，大剂量培哚普利比小剂量培哚普利改善心功能的效果显著(P<0.05)；心功能障碍家兔应用培哚普利后，血清Ang-(1-9)和Ang-(1-7)水平均增高(P<0.01)，ACE2和AT2R mRNA表达均增加(P<0.01)；与小剂量组相比，大剂量组心肌ACE2和AT2R mRNA表达均增高(P<0.01)，血清Ang-(1-9)水平增高(P<0.05)，血清Ang-(1-7)水平无明显增加。相关性分析发现，左室射血分数与血清Ang-(1-9)、ACE2及AT2R水平呈正相关关系(P<0.01)，与血清Ang-(1-7)水平无相关关系。结论：大剂量培哚普利较小剂量培哚普利可以更有效改善缺血性心功能障碍家兔心功能，其心功能的改善可能与Ang-(1-9)水平增多，引起AT2R活化相关。

[关键词]培哚普利；心功能障碍； 血管紧张素-(1-9)； 血管紧张素-(1-7)

血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin-converting enzyme inhibitor，ACEI)在心力衰竭的治疗中起基石作用，为心力衰竭管理指南推荐用药[1-3]。不同指南推荐ACEI应用剂量不一致，国内培哚普利应用量偏小。ACE2由Tipnis等[4]发现，其催化产物为血管紧张素(angiotensin,Ang)-(1-9)和Ang-(1-7)。不同剂量的ACEI能否通过ACE2/Ang-(1-9)/ Ang-(1-7)轴发挥心脏保护性作用尚不完全明确。本研究给予心肌梗死后心功能障碍家兔不同剂量ACEI培哚普利，观察家兔心肌血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)及血管紧张素2型受体(angiotensin type 2 receptor,AT2R)表达、血清Ang-(1-9)及Ang-(1-7)水平和心功能的变化，观察不同剂量培哚普利治疗心功能障碍的差别，并探讨可能机制。

材料和方法

1实验动物

本实验选用健康3月龄新西兰雄性家兔共30只，体重约(2.73±0.13)kg，由河北医科大学实验动物中心提供。

2主要实验试剂及仪器

培哚普利片(雅施达制药有限公司)；注射用青霉素钠(华北制药)；反转录试剂盒、随机引物(Promega)；荧光定量PCR试剂盒(BBI)；PCR引物(上海生工生物工程有限公司)；Ang-(1-9)及Ang-(1-7)试剂盒(上海蓝基生物科技有限公司)。心脏超声仪(TOSHIBA)；7300荧光定量PCR仪(ABI)；紫外可见分光光度仪(北京普析通用仪器有限责任公司)。

3方法

3.1动物分组及处理30只家兔随机分为大剂量培哚普利(high-dose perindopril, HD)组、小剂量培哚普利(low-dose perindopril，LD)组及心功能障碍(cardial dysfunction, CD)组。心肌梗死2周后左室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF)低于50%为模型制作成功。模型制作成功后3组均以2 mL·kg-1·d-1灌胃4周(药物浓度分别为1 g/L、0.33 g/L、0 g/L)。

3.2实验动物模型制备采用结扎前降支的方法制作心功能障碍模型。记录术前心电图后开胸结扎冠状动脉前降支，模型制备成功标准为心尖部及左室前壁由红色变为暗紫色，局部心肌运动异常，心电图示胸前导联ST段持续弓背向上抬高[5]。术后3 d每天青霉素80万单位肌注。

3.3超声心动图检测心功能术前、术后2周及给药后4周由同一专科医生行超声心动图检查，测量各组LVEF和左室舒张末期内径(end diastolic diameter，EDD)。所有测量值均取3次测量的平均值。

3.4Real-time PCR法检测心肌组织ACE2及AT2R mRNA的表达给药4周后，取50 mg心肌梗死区域心肌组织进行研磨，提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性；按照反转录试剂盒说明书进行反转录，反应条件为：42 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min。GAPDH的上游引物为5′-CGCCTGGAGAAAGCTGCTAA-3′，下游引物为5′-CGACCTGGTCCTCGGTGTAG-3′，扩增产物为103 bp[5]；ACE2的上游引物为5′-CAACACTTGAACCCCCTTATGA-3′，下游引物为5′-TGCTTTTGCTTCCTTCGGTC-3′，扩增产物为133 bp；AT2R的上游引物为5′-GAAATCTACAGAGCAGCAACAGGA-3′，下游引物为5′-CATTGGAGCAGGTACAAGTGG-3′，扩增产物为129 bp。将获得的cDNA按照实时荧光定量PCR试剂盒操作说明书方法扩增目的基因，PCR热循环参数为96 ℃ 4 min，然后3步反应：94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。以GAPDH为内参照，将目的基因表达的相对定量值用于统计学分析。Real-time PCR采用2-ΔΔCt(ΔCt=目的基因Ct值-GAPDH Ct值，ΔΔCt=目的基因ΔCt值-内参照基因ΔCt值)法计算结果[6]。将所得的AT2R mRNA表达量与LVEF进行相关性分析。

3.5ELISA法检测血清中Ang-(1-9)和Ang-(1-7)的含量用药4周后，家兔麻醉后腹主动脉取血，离心15min后取上清，按照ELISA试剂盒说明书进行操作；依据标准品浓度及其A值计算相应公式；依据公式和样品A值计算样品Ang-(1-9)和Ang-(1-7)的浓度。

4统计学处理

使用SPSS 13.0软件包进行数据处理，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用完全随机设计的单因素方差分析(one-way ANOVA)，多个样本间两两比较采用SNK-q检验；相关变量间采用直线相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1心肌梗死后心功能障碍模型结果

30只新西兰雄性家兔接受模型手术，术后共有25只存活，其中大剂量组9只，小剂量组8只，心功能障碍组8只。

2心脏超声检查结果

心肌梗死后2周心脏超声显示3组的LVEF及EDD无明显区别；给药4周后，大剂量组的LVEF较小剂量组及心功能障碍组显著升高，小剂量组较心功能障碍组显著升高；大剂量组的EDD较小剂量组及心功能障碍组显著减小，小剂量组较心功能障碍组无明显差异。见图1、表1。

Figure 1.Comparison of cardiac function in different groups after 4 weeks treatment.

图1各组间给药4周后超声心动图

表1各组间给药4周后LVEF和EDD的比较

Table 1.Comparison of LVEF and EDD in different groups after 4 weeks treatment (Mean±SD.n=8～9)

GroupLVEFEDDHD50.61±3.21#12.67±0.35#LD46.44±1.66*13.33±0.27CD41.56±4.2713.69±0.49

*P<0.05vsCD group；#P<0.05vsLD group.

3心肌梗死区域组织ACE2和AT2R mRNA表达

与心功能障碍组相比，小剂量组ACE2及AT2R的mRNA表达均明显增高；与小剂量组相比，大剂量组ACE2及AT2R的mRNA表达明显增高。相关性分析显示，心功能障碍家兔心功能与ACE2及AT2R的mRNA表达水平均呈正相关(P<0.01)，相关系数分别为0.720和0.613，见表2。

表2梗死区域ACE2及AT2R mRNA表达水平的比较

Table 2.The levels of ACE2 and AT2R mRNA expression in infracted zone(Mean±SD.n=8～9)

GroupACE2mRNAAT2RmRNA HD0.984±0.138#0.985±0.137# LD0.410±0.143*0.488±0.140* CD0.246±0.0800.291±0.086

*P<0.05vsCD group；#P<0.05vsLD group.

4血清Ang-(1-9)与Ang-(1-7)水平

与心功能障碍组相比，小剂量组血清Ang-(1-9)及Ang-(1-7)水平均明显增高；与小剂量组相比，大剂量组血清Ang-(1-9)水平明显增高，但血清Ang-(1-7)水平未见明显增高；相关性分析显示，心功能障碍家兔心功能与血清Ang-(1-9)水平呈正相关(P<0.01)，相关系数为0.683；心功能与血清Ang-(1-7)水平未见相关性，见表3。

表3血清Ang-(1-9)及Ang-(1-7) 的比较

Table 3.The levels of serum Ang-(1-9) and Ang-(1-7)(μg/L.Mean±SD.n=8～9)

GroupAng-(1-9)Ang-(1-7)HD4.706±0.310#4.462±0.525LD3.857±0.493*4.033±0.640*CD3.033±0.2852.727±0.192

*P<0.05vsCD group;#P<0.05vsLD group.

讨论

在心功能障碍的发生和进展过程中，肾素-血管紧张素-醛固酮系统和交感神经系统的激活起着重要的作用。肾素-血管张素-醛固酮系统激活，AngII及醛固酮蓄积，分别作用于相应受体，产生血管收缩、水钠潴留及成纤维细胞增殖等作用。ACEI作为心力衰竭治疗的基石，各大指南均有推荐而不同指南对ACEI剂量的应用推荐并不一致。除增强对肾素-血管紧张素-醛固酮系统、激肽释放酶-激肽系统及交感神经系统等的作用外，各剂量ACEI在ACE2/Ang-(1-9)/Ang-(1-7)轴的作用差异尚不明确。

ACE2可以催化AngII形成Ang-(1-7)，也可以催化AngI形成Ang-(1-9)，而Ang-(1-9)则可以通过ACE催化形成Ang-(1-7)。本研究在心肌梗死后心功能障碍动物模型应用不同剂量的ACEI代表药物培哚普利，观察大、小剂量培哚普利改善心功能的作用及其对ACE2/Ang-(1-9)/Ang-(1-7)轴的作用。

作为ACE2/Ang-(1-9)/Ang-(1-7)轴的下游因子，Ang-(1-7)激活Mas受体发挥心脏血管保护作用，这已得到广泛的证实[7-10]。作为Ang-(1-7)的前体，Ang-(1-9)受到的关注程度远不如Ang-(1-7)。近年研究发现，Ang-(1-9)作为一种血管紧张肽，也有心血管保护作用。

本研究发现，在心功能障碍家兔，应用培哚普利可明显改善心功能，且大剂量组较小剂量组心功能改善更显著；与心功能障碍组相比，应用培哚普利明显增加ACE2表达，大剂量组ACE2作用更明显；与心功能障碍组相比，培哚普利可明显增加血清Ang-(1-9)水平，大剂量组血清Ang-(1-9)水平更高。说明培哚普利可以通过ACE2/Ang-(1-9)/Ang-(1-7)轴发挥心脏保护作用，同时也说明大剂量培哚普利可以通过调节ACE2/Ang-(1-9)/Ang-(1-7)轴发挥更强的心脏保护作用。但大剂量培哚普利并不能明显升高血清Ang-(1-7)水平，说明大剂量培哚普利与小剂量相比主要通过Ang-(1-9)增多发挥作用。

有研究显示在血管紧张素受体家族中还存在AT2R，具有拮抗AT1R的作用，但AT2R在成年个体中表达水平较低[11-12]。Ang-(1-9)可以对抗Ang II引起的心肌细胞肥大，并受到AT2R阻滞剂PD123319的阻断[13]。Ang-(1-9)在心衰动物模型可以发挥剂量依赖的血管舒张作用，同样该作用被AT2R受体阻滞剂阻断[14]。最近有研究显示Ang-(1-9)可以增加心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)的分泌，并可被AT2R阻滞剂所阻断[15]。上述研究中加入Mas受体阻滞剂并不能阻断Ang-(1-9)的上述作用，说明Ang-(1-9)可以通过激活AT2R发挥其对心血管系统的直接保护作用。

本研究显示缺血性心功能障碍家兔应用培哚普利后心肌AT2R mRNA表达显著升高，大剂量组升高更明显；且3组血清Ang-(1-9)水平依次递减，提示培哚普利可能通过Ang-(1-9)增加AT2R表达。AT2R与心功能呈正相关关系，说明ACEI可以通过增加血清Ang-(1-9)水平，进而激活AT2R来发挥延缓心脏重构、改善心功能等心血管保护性作用。大剂量组血清Ang-(1-7)水平较小剂量组没有显著升高，提示大剂量组较小剂量组改善心功能除了已知的更能有效抑制肾素-血管紧张素-醛固酮、抑制交感神经等，还可以通过新型肾素-血管紧张素-醛固酮系统发挥其心脏保护功能，并且大剂量ACEI主要通过增加Ang-(1-9)而不是Ang-(1-7)来发挥其作用。有研究者推测Ang-(1-9)可能是一种内生的血管紧张素转换酶抑制剂。注射了Ang-(1-9)的心肌梗死大鼠，与对照组相比，血清和左室心肌ACE活性及血清AngII水平显著降低[16]。说明Ang-(1-9)可能可以作为一种静脉用药物用于心功能障碍和心肌梗死的治疗。但这需要更多的动物实验和临床研究来验证。

本研究通过给予心肌梗死后心功能障碍家兔不同剂量培哚普利药物治疗，改善心功能障碍家兔的心功能，验证了大剂量培哚普利在心功能障碍治疗中的肯定作用；探讨了大剂量培哚普利较小剂量培哚普利改善心功能障碍家兔心功能的可能机制；证实了大剂量培哚普利可以通过调节ACE2/Ang-(1-9)/Ang-(1-7)轴发挥心血管保护性作用。但由于目前AT2R的作用机制尚不完全明确，并且缺乏特异性AT2R阻滞剂，尚需要更多的研究证实Ang-(1-9)对AT2R的作用。

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(责任编辑： 陈妙玲， 余小慧)

Effects of perindopril at different doses on cardiac function and ACE2/Ang-(1-9)/Ang-(1-7) axis of ischemic cardiac dysfunction rabbits

HAO Xiao, LI Shu-ren, MENG Tian-tian, GAO Qing, DANG Yi, XUN Li-ying，YUAN Ke-xin, ZHANG Qian-hui, HAO Qing-qing, QI Xiao-yong

(DepartmentofCardiology,HebeiGeneralHospital,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050051,China.E-mail:lsr64@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the different dose of perindopril on cardiac function in the rabbits with ischemic cardiac dysfunction. METHODS: Male rabbits weighing 2.5～3.0 kg (n=30) were randomly divided into 3 groups (n=10): high dose perindopril group (HD group), low dose perindopril group (LD group) and cardiac dysfunction group (CD group). The Left anterior descending coronary artery of the rabbits was ligatured for model preparation. In HD group, the rabbits were treated with perindopril split normal saline solution (1 g/L)2 mL·kg-1·d-1. In LD group, the rabbits were treated with perindopril split normal saline solution (0.33 g/L)2 mL·kg-1·d-1. In CD group, the rabbits were treated with normal saline solution 2 mL·kg-1·d-1. Four weeks after treatment, the cardiac function was measured via echocardiography, the mRNA expression of angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2)and angiotensin type 2 receptor (AT2R) was analyzed by real-time PCR, serum angiotensin (Ang)-(1-9) and Ang-(1-7) levels were detected by ELISA. RESULTS: Compared with CD group, the cardiac function of the 2 groups treated with perindopril was significantly improved (P<0. 01), and more improvement in HD group was observed than LD group (P<0.05). The serum angiotensin (Ang)-(1-9) and Ang-(1-7) level and the mRNA expression of ACE2 and AT2R in the 2 groups treated with perindopril were significantly improved (P<0.01). Compared with LD group, the mRNA expression of ACE2 and AT2R and the serum levels of Ang-(1-9) in HD group were significant improved (P<0.05), while no difference of serum Ang-(1-7) level was observed. Correlation analysis revealed that the improvement of the cardiac function was associated with serum Ang-(1-9) level, mRNA expression of ACE2 and AT2R (P<0.01), but has no significant correlation with serum Ang-(1-7) level. CONCLUSION: High dose of perindopril may improve more cardiac function in ischemic cardiac dysfunction model in rabbits. The mechanism may relate to increasing serum Ang-(1-7) level to activate AT2R.

[KEY WORDS]Perindopril; Cardiac dysfunction; Angiotensin-(1-9); Angiotensin-(1-7)

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.028

[中图分类号]R363

[文献标志码]A

通讯作者△Tel: 0311-85988732; E-mail: lsr64@126.com

[收稿日期]2015- 11- 04[修回日期] 2015- 12- 24

[文章编号]1000- 4718(2016)03- 0554- 05

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