ClC-3基因过表达对小鼠骨量和骨结构的影响*

汪　源，　邓志钦，　吕瑞玲，　王海波，　高　宏，　梁协稠，　谭秋婵，　朱林燕，　李青南，　王立伟△，　陈丽新△

(暨南大学医学院 1生理学系， 2药理学系，广东 广州 510632； 3广东药学院生命科学与生物制药学院，广东 广州 510006)



ClC-3基因过表达对小鼠骨量和骨结构的影响*

汪源1，邓志钦1，吕瑞玲1，王海波2，高宏2，梁协稠1，谭秋婵1，朱林燕2，李青南3，王立伟1△，陈丽新2△

(暨南大学医学院1生理学系，2药理学系，广东 广州 510632；3广东药学院生命科学与生物制药学院，广东 广州 510006)

[摘要]目的： 研究过表达电压门控氯通道家族蛋白成员3(voltage-gated chloride channel family protein 3, ClC-3)基因对小鼠骨骼的影响。方法：3月龄雄性FVB小鼠用鼠尾基因检测法确定基因型后分为2组：野生型(WT)组和ClC-3过表达(ClC-3 transgene)组，每组各8只。分别测量2组小鼠体重，右侧胫骨长度和重量。取胫骨上段和中段进行脱钙，石蜡包埋，切片，HE染色后，采用骨形态计量学分析胫骨上段松质骨的骨小梁面积百分数(percent trabecular area, %Tb.Ar)、骨小梁数量(trabecular number, Tb.N)、骨小梁宽度(trabecular width, Tb.Wi)、骨小梁分离度(trabecular separation, Tb.Sp)和胫骨中段皮质骨的骨组织总面积(total tissue area, T.Ar)、皮质骨面积(cortical area, Ct.Ar)、皮质骨面积百分数(percent cortical area, %Ct.Ar)、骨髓腔面积(marrow area, Ma.Ar)、骨髓腔面积百分数(percent marrow area, %Ma.Ar)。结果：小鼠经鼠尾基因检测后确认为野生型或ClC-3过表达型。与WT组相比，ClC-3 transgene组小鼠体重及胫骨长度重量均减小(P<0.05)；松质骨的%Tb.Ar和Tb.Wi均减小(P<0.05)，Tb.Sp增大(P<0.05)，Tb.N的变化无统计学意义；皮质骨的T.Ar、Ct.Ar和%Ct.Ar均减小(P<0.05)，%Ma.Ar增大(P<0.05)，Ma.Ar的变化无统计学意义。结论：ClC-3过表达导致小鼠的皮质骨和松质骨骨量减少，骨结构变差，提示ClC-3可能参与了骨形成和/或骨吸收。

[关键词]电压门控氯通道家族蛋白成员3； 骨形态计量学； 松质骨； 皮质骨

骨骼是一个不断更新的系统，新骨的形成与旧骨的吸收处于动态平衡，众多因素参与了骨的生长及改建[1]。研究表明骨代谢与Ca2+、K+等多种离子通道密切相关，而氯通道作为生物体内最重要的阴离子通道参与多种生理和病理生理过程，其对骨生长的影响已引起了人们的关注。如电压门控氯通道家族蛋白成员3(voltage-gated chloride channel family protein 3,ClC-3)基因敲除的小鼠表现出生长阻滞及骨骼生长异常[2]，提示ClC-3氯通道与骨代谢有密切关系。

ClC-3氯通道由CLCN3基因编码，是电压门控氯通道(voltage-gated chloride channel, ClC)家族中的一员，广泛分布于脑、肾、心脏、骨骼肌、胰腺和肾上腺等组织。ClC-3在质膜、细胞核、细胞器上都有表达，并且参与了细胞的容积调节、周期调节、凋亡等多种生理活动，在肿瘤的生长和转移中也有重要作用[3-5]。有报道ClC-3在成骨细胞和破骨细胞上均有表达，且ClC-3通过调节细胞器的酸化作用来参与破骨细胞的骨吸收功能[6]。在小鼠成骨细胞的骨诱导过程中，ClC-3蛋白表达可以通过Runx2基因促进成骨分化[7]。但ClC-3过表达对骨骼的影响目前还不清楚。本研究以ClC-3过表达小鼠为研究对象，观察胫骨松质骨和皮质骨的骨量与骨结构的变化，以了解ClC-3在小鼠骨生长中的作用。

材料和方法

1实验材料

鼠尾基因检测试剂盒购于康为世纪有限公司;Taq酶、DNA marker DL1000、琼脂糖购于大连宝生物工程有限公司；小鼠鉴定引物和内参照均由Invitrogen合成；固体石蜡、EG1160型石蜡包埋机、RM2255型切片机为Leica产品;Bioquant-Osteo骨形态学图像分析系统为BIOQUANT产品。

2实验动物及鉴定

ClC-3过表达转基因小鼠委托Cyagen Biosciences构建，项目协议编号为TGS120401AH01。质粒名称为pLV.EX3d.P/neo-EF1A>CLCN3>IRES/eGFP。小鼠品系为FVB。SPF级环境中分笼饲养，室温22～28 ℃，相对湿度40%～60%，昼夜交替，隔日更换垫料，自由摄食摄水。

剪取4周龄小鼠尾尖0.4 cm～0.6 cm，参照鼠尾DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA后测DNA浓度并将各样本调至相同浓度，PCR反应扩增clc-3基因。上游引物序列为5′-TTGCCTACTATCACCACGAC-3′，下游引物序列为3′-GCATCTCCAACCCATTTACT-5′，产物大小为440 bp。PCR总体系为50 μL：2×Taq Master Mix 25 μL，PCR引物上、下游引物各1 μL，基因组DNA 1 μL，ddH2O 22 μL。反应条件为：94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，64 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循环35次;72 ℃ 2 min，4 ℃保存。取10 μL PCR产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统分析结果。根据该结果将小鼠分为野生型(WT)组和ClC-3过表达(ClC-3 transgene)组，每组各8只，然后继续饲养至3月龄。

3骨标本脱钙包埋及制片

小鼠称重后用戊巴比妥钠麻醉，再经心脏抽血处死，取右侧胫骨称重测量长度。按图1所示锯出上段和中段。10%的EDTA脱钙约28 d,可以用大头针轻轻刺进者为脱钙完全。石蜡包埋后切4 μm薄片，HE染色后显微镜下观察拍照。

Figure 1.The material parts of proximal and middle part of tibia.

图1胫骨上段和中段取材部位

4骨组织形态计量学检测

本实验所有参数采用国际通用标准骨组织形态计量学术语命名，经BIOQUANT OSTEO骨组织形态图像分析系统测量获得二维参数如骨小梁总面积，骨小梁面积，骨小梁周长等等，再运用公式进行计算得到三维参数如骨小梁面积百分数，骨小梁数量，骨小梁厚度，骨小梁分离度等等。根据骨组织形态计量学中这些参数的定义和意义对骨量、骨结构等进行分析。

5统计学处理

用Sigma Plot 10.0软件进行统计分析。数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，t检验比较组间差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1ClC-3过表达小鼠基因型鉴定

本实验中过表达转基因小鼠导入质粒为pLV. EX3d. P/neo-EF1A>CLCN3>IRES/eGFP，PCR体系中所设计的引物是从GFP基因开始的，所以在长波紫外光下观察琼脂糖凝胶上的PCR条带时，ClC-3过表达小鼠在440 bp处出现条带，野生型小鼠在该处不出现条带，200 bp为内参照，见图2。

Figure 2.Identification of ClC-3 overexpressed mice. 1: marker; 2～8: ClC-3 overexpressed mice; 9～10: WT mice.

图2ClC-3过表达小鼠基因型鉴定

2小鼠体重及胫骨长度重量的变化

小鼠麻醉后观察到ClC-3 transgene组小鼠个头略小，见图3。取出胫骨后观察到ClC-3 transgene组胫骨的长度比WT组的短，见图4。称重及测量长度后结果显示：与WT组相比，ClC-3 transgene组小鼠体重减轻(P<0.05)，且胫骨长度和重量均减少(P<0.05)，见表1。

Figure 3.Morphological comparison of WT and ClC-3 transgene mice.

图3野生型和ClC-3过表达小鼠的形态比较

Figure 4.Morphological comparison on tibia of WT and clc-3 transgene mice.

图4野生型和ClC-3过表达小鼠胫骨的形态比较

表1ClC-3过表达对小鼠体重及胫骨长度和重量的影响

Table 1.Effects of ClC-3 overexpression on the body weight and the length and weight of the tibias of mice (Mean±SD.n=8)

GroupBodyweight(g)Weightoftibia(mg)Lengthoftibia(mm)WT23.41±2.3058.30±6.7718.35±1.10ClC-3transgene21.17±3.07*49.27±6.29*16.58±0.91*

*P<0.05vsWT.

3松质骨形态计量学参数的变化

图5所示为胫骨上段冠状面HE染色图，图中紫红色条状部分为骨小梁，其周围包绕的是骨髓，左右两边紫红色部分为皮质骨。可观察到WT组骨小梁排列有序密集，骨小梁之间连接较多且间距小；ClC-3 transgene骨小梁变窄，数量减少。骨形态计量学结果显示：与WT组相比，ClC-3 transgene组小鼠松质骨骨小梁面积百分数(percent trabecular area, %Tb.Ar)、骨小梁宽度(trabecular width, Tb.Wi)均减小(P<0.05)，骨小梁分离度(trabecular separation, Tb.Sp)增加(P<0.05)，骨小梁数目(trabecular number, Tb.N)减小，但其变化无统计学意义，整体表现为骨量减少，骨结构变差，见表2。

Figure 5.Effects of ClC-3 overexpression on the cancellous bone of the proximal tibia in mice (×5). Proximal tibia were dissected, decalcified, paraffin-imbed, sectioned and stained with HE staining. A: WT group; B: ClC-3 transgene group.

图5ClC-3过表达对小鼠胫骨上段松质骨的影响

表2ClC-3过表达对小鼠胫骨上段松质骨静态参数的影响

Table 2.Effects of ClC-3 overexpression on the histomorphometric parameters of the cancellous bone of the proximal tibia in mice (Mean±SD.n=8)

Group%Tb.Ar(%)Tb.Wi(μm)Tb.N(mm-1)Tb.Sp(μm)WT14.46±2.4330.56±4.254.74±0.56182.86±24.04ClC-3transgene9.66±2.50*26.12±1.70*3.67±1.20268.54±83.08*

*P<0.05vsWT.

4皮质骨形态计量学参数的变化

图6所示为胫骨中段横断面HE染色图，图中外圈紫红色部分为皮质骨，内圆部分为骨髓腔。可观察到WT组皮质骨面积百分比较大，ClC-3 transgene组皮质骨面积百分比较小，2组骨髓腔面积大小几乎没有差异。骨形态计量学结果显示：与WT组相比，ClC-3 transgene组小鼠皮质骨的骨组织总面积(total tissue area, T.Ar)、皮质骨面积(cortical area, Ct.Ar)和皮质骨面积百分数(percent cortical area, %Ct.Ar)均减少(P<0.05)，骨髓腔面积百分数(percent marrow area, %Ma.Ar)增大(P<0.05)，见表3。

Figure 6.Effects of ClC-3 overexpression on the cortical bone of the middle part of tibia shaft in mice (×5). Middle part of tibia shaft were dissected, decalcified, paraffin-imbed, sectioned and stained with HE staining. A: WT group; B: ClC-3 transgene group.

图6ClC-3过表达对小鼠胫骨中段皮质骨的影响

表3ClC-3过表达对小鼠胫骨中段皮质骨静态参数的影响

Table 3.Effects of ClC-3 overexpression on the histomorphometric parameters of the cortical bone of the tibia shaft (middle part) in mice (Mean±SD.n=8)

GroupT.Ar(mm2)Ct.Ar(mm2)%Ct.Ar(%)Ma.Ar(mm2)%Ma.Ar(%)WT0.95±0.090.67±0.0870.53±1.570.28±0.0229.47±1.38ClC-3transgene0.71±0.06*0.44±0.04*61.97±2.11*0.27±0.0338.03±2.61*

*P<0.05vsWT.

讨论

FVB小鼠因其受精卵易于显微注射DNA而常用于转基因动物实验，成熟期为8～10周，3月龄时其性腺与内分泌系统已完全发育成熟，肌肉骨骼系统基本定型。研究发现雌激素水平的下降可导致成骨细胞功能和活性降低，使破骨细胞凋亡受抑制进而造成骨丢失[8-9]。因此本研究为了降低雌激素及年龄对小鼠的影响，选择了雄性3月龄的FVB小鼠进行研究。

成人的骨骼主要由皮质骨组成，约占80%，构成骨的外层；而松质骨仅占20%，主要位于骨的中心部分。松质骨由分枝的骨小梁构成一个间隙互相连通的错综复杂的立体网格，其周围包绕骨髓。皮质骨结构致密，为坚硬致密的连续体。胫骨由于血供和营养丰富，代谢功能活跃，骨的再生能力强，骨转化率比较高，是各种骨质疏松模型和防治药物研究的较理想部位。所以本研究选取胫骨作为研究部位。

骨组织形态计量学是能定量地观察和研究骨组织形态及其结构的一门体视学技术，是骨质疏松动物实验及骨质疏松防治药物药效试验中重要的评价指标，是为临床提供理论指导的重要科研手段[10]。骨小梁面积百分数能反映骨量的多少，是评价骨量变化的最重要的指标。骨小梁厚度和骨小梁数量用于描述骨小梁形态结构，它们与骨量的变化呈正相关。骨小梁分离度指骨小梁之间的平均距离，分离度越大骨就越疏松。皮质骨骨组织总面积指整个横断面面积，代表骨外膜形成的情况。皮质骨面积反映皮质骨骨量的多少，能综合反映内外骨面的变化。皮质骨面积百分数是指皮质骨占总面积的百分比。骨髓腔面积反映骨内膜骨吸收的情况，增大表示骨吸收增加或骨形成的减少，不变化表示骨吸收和骨形成达到动态平衡，缩小表示骨吸收减少或骨形成增加。骨髓腔面积百分数是指骨髓腔占总面积的百分比。

已有研究报道ClC-3基因缺陷的小鼠表现为生长迟缓，体重减轻，比野生型的个头小[2]。而本实验结果显示ClC-3过表达小鼠体重减轻，这可能因为机体ClC-3表达差异导致生长受到抑制，并且胫骨重量减小也是体重减轻的一个重要原因。提示ClC-3缺失或过多均不利于小鼠的生长发育，ClC-3在一定范围内适量的表达才能使小鼠正常生长发育。

本实验结果显示，ClC-3过表达小鼠胫骨上段松质骨的%Tb.Ar和Tb.Wi均减小，Tb.Sp增大，Tb.N的变化没有统计学意义。说明ClC-3过表达使小鼠松质骨的骨微化结构发生退化，骨量和骨结构均出现了改变，且ClC-3过表达主要是减小骨小梁宽度从而使骨量减少，而对骨小梁的的数目影响较小。破骨细胞发挥的破骨作用和成骨细胞发挥成骨作用是相互联系的[11-12]，提示ClC-3过表达使成骨细胞的骨重建与破骨细胞骨吸收的平衡被打破，继而导致骨丢失。同时本研究表明，ClC-3过表达小鼠皮质骨的T.Ar 和%Ct.Ar均减小，%Ma.Ar增大，提示ClC-3过表达也降低了小鼠皮质骨骨量，这可能与皮质骨内外膜的骨吸收增加和骨形成减少有关。

综上所述，ClC-3过表达对小鼠的松质骨和皮质骨的骨量和骨结构都有影响，骨骼质量下降，提示ClC-3可能参与了机体的骨吸收和/或骨形成的调节过程，具体机制还有待进一步研究。

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(责任编辑： 林白霜， 余小慧)

Effects ofClC-3 gene overexpression on bone mass and structure in mice

WANG Yuan1, DENG Zhi-qin1, LÜ Rui-ling1, WANG Hai-bo2, GAO Hong2, LIANG Xie-chou2, TAN Qiu-chan1, ZHU Lin-yan2, LI Qing-nan3, WANG Li-wei1, CHEN Li-xin2

(1DepartmentofPhysiology,2DepartmentofPharmacology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;3SchoolofLifeScienceandBiopharmacy,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China.E-mail:tchenlixin@jnu.edu.cn;twangliwei@jnu.edu.cn)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of the overexpression of voltage-gated chloride channel family protein 3 (ClC-3) gene on bones of mice. METHODS: The tail gene detection assay was used to confirm the overexpression of ClC-3. The male FVB mice of three months old were divided into two groups, the wild type (WT) group and the ClC-3 overexpressed (ClC-3 transgene) group. The body weight, length and weight of the right tibias were measured. The upper and middle parts of the tibias were dissected, decalcified, paraffin-imbed, sectioned and stained with HE staining. The bone morphology metrology was used to analyze the changes of bone structures. The percent trabecular area (%Tb.Ar), trabecular number (Tb.N), trabecular width (Tb.Wi) and trabecular separation (Tb.Sp) of cancellous bone in the upper part of the tibia were measured. The total tissue area (T.Ar), cortical area (Ct.Ar), percent cortical area (%Ct.Ar), marrow area (Ma.Ar) and percent marrow area (%Ma.Ar) of the cortical bone in the middle part of the tibia were detected . RESULTS: The wild type mice and the ClC-3-overexpressed mice were verified by the tail gene detection assay. Compared with WT group, the body weight and the length and weight of the tibia were decreased in ClC-3 transgene mice (P<0.05). In the cancellous bones of ClC-3 transgene mice, the %Tb.Ar and Tb.Wi were decreased (P<0.05), the Tb. Sp was increased (P<0.05) and the Tb. N was not significantly changed. In the cortical bones of ClC-3 transgene mice, the T.Ar, Ct. Ar and %Ct.Ar were decreased (P<0.05), the % Ma.Ar was increased (P<0.05), and the Ma.Ar was not significantly changed. CONCLUSION: ClC-3 overexpression may lead to the reduction of the bone mass and the destructure of the cancellous and cortical bones. The results suggest that ClC-3 may be involved in the regulation of bone resorption and/or formation.

[KEY WORDS]ClC-3; Bone morphometry; Cancellous bone; Cortical bone

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.018

[中图分类号]R336; R363

[文献标志码]A

通讯作者△陈丽新Tel: 020-85228865; E-mail: tchenlixin@jnu.edu.cn; 王立伟Tel: 020-85226565; E-mail: twangliwei@jnu.edu.cn

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No.81273539; No.81272223; No.81173064)；教育部基金资助项目(No.20124401110009);广州市科技计划基金项目(No.2013J450015);广东省科技计划项目(No.2013B051000059)

[收稿日期]2015- 11- 16[修回日期] 2016- 01- 04

[文章编号]1000- 4718(2016)03- 0499- 05

杂志网址： http://www.cjpp.net