止血带休克后主动脉收缩反应性及RAS成分的变化*

王丽君，　王建辉，　王玉娟，　范素净，　朱丽艳，　杨秀红△

(1华北理工大学基础医学院生理教研室, 2唐山市第九医院，河北 唐山 063000)



止血带休克后主动脉收缩反应性及RAS成分的变化*

王丽君1，王建辉1，王玉娟2，范素净1，朱丽艳1，杨秀红1△

(1华北理工大学基础医学院生理教研室,2唐山市第九医院，河北 唐山 063000)

[摘要]目的： 通过观察止血带休克(tourniquet shock，TS)后主动脉收缩反应性及肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)的变化，探讨RAS稳态失衡在止血带休克后主动脉低反应性及损伤中的作用。方法: 8月龄C57BL/6的雄性小鼠，分为对照组及6个模型组，每组6只。模型组进行止血带套扎双后肢阻断血流，2 h后解套扎进行再灌注，分别于再灌注10 min、1 h、2 h、4 h、6 h和12 h后处死，对照组不进行套扎与再灌注，其余操作同模型组；多普勒血流仪测定肢体血流，颈动脉插管法测定平均动脉压(MAP)，离体血管张力测定仪测定主动脉收缩反应性，HE染色结合透射电镜评价血管形态学损伤；Western blot检测血管组织中血管紧张素Ⅱ 1型受体(AT1受体)、血管紧张素(1-7)受体(Mas受体)、血管紧张素转换酶(ACE)和ACE2蛋白的表达。采用ELISA检测血清中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和血管紧张素(1-7)[Ang(1-7)]的含量。结果: 与对照组相比，模型组出现下述变化：(1) 随着再灌注时间的延长血流量逐渐减少；MAP在再灌注10 min明显升高，随后逐渐降低；血管对去甲肾上腺素的反应性在再灌注10 min升高随后下降，再灌注4 h的血管反应性最低；形态学损伤评分随再灌注时间延长逐渐增高;(2) 主动脉AT1受体与ACE2蛋白表达逐渐下降，Mas受体与ACE蛋白表达逐渐升高;(3) 血清中AngⅡ的含量整体呈升高趋势，Ang(1-7)的含量整体呈降低趋势。结论: 主动脉收缩反应性在休克初期暂时升高，随后降低，其发生机制可能与血管形态学损伤及 RAS失衡有关。

[关键词]止血带休克； 主动脉； 血管收缩反应性； 肾素-血管紧张素系统

止血带休克是指松解结扎时间过长的止血带后，机体由于各种毒素刺激以及有效循环血量不足导致的以神经-体液因子失调与急性循环障碍为特征的危重状态，是创伤性休克的一种[1]。研究表明：在休克的代偿期血管反应性是短暂升高的；而休克晚期由于机体代偿机制不足以对抗休克引起的各种损伤，血管反应性持续降低，出现难治性低血压[2]，血管对所用药物不敏感甚至无反应，导致血压提升不良,不能进行有效组织灌注，因此细胞缺氧和损伤进一步加重[3]。肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)是体内重要的体液调节系统，包括血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)/血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)/血管紧张素Ⅱ的1型受体(AT1受体)与血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)/血管紧张素(1-7)[angiotensin(1-7)，Ang(1-7)]/血管紧张素(1-7)的受体(Mas受体)两条作用轴，以循环RAS和局部RAS两种作用方式调节体内多个脏器的功能。本实验室前期研究发现肢体缺血再灌注后，RAS稳态明显失衡，其可造成远隔器官如肾脏、肺脏的急性损伤[4-5]。然而，RAS稳态失衡在止血带休克后主动脉低反应性及损伤中的作用国内外尚无报道。本实验采用止血带休克模型，应用多普勒血流测定技术、颈动脉插管测压法和微血管张力测定技术观察不同再灌注时点动物的主动脉血流动力学及血管反应性的改变，病理学方法评价主动脉损伤程度，Western blot法和ELISA法测定主动脉及血清中RAS成分的变化，研究止血带休克后RAS失衡与血管低反应性及损伤的关系。

材料和方法

1动物

随机选取野生型C57BL/6小鼠，雄性，体重26～30 g，8月龄；所用动物均由中国医学科学院实验动物研究所提供，所有动物活体实验在SPF微生物学控制的条件下进行。

2主要试剂

K-H液[成分(mmol/L)：NaCl 11.8,KCl 4.7,MgSO4·7H2O 1.2,CaCl22.5,NaHCO324.7,葡萄糖11.0;均购自天津市北辰方正试剂厂]；重酒石酸去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)购自天津金耀氨基酸有限公司；氯化乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)购自国药集团化学试剂有限公司；蛋白提取试剂盒、蛋白浓度测定试剂盒、Western blot蛋白Marker、封闭液、 Ⅱ 抗、抗体稀释液、TEMED和GAPDH抗体均为碧云天试剂公司产品；AT1受体和ACE2抗体均购自Santa Cruz；ACE抗体购自Epitomics；Mas受体抗体购自Alomone Labs；AngⅡ和Ang(1-7)酶联免疫吸附测定试剂盒购自武汉优尔生科技股份有限公司。

3主要方法

3.1动物分组与模型制备随机分为7组，每组各6只动物，即对照组以及缺血2 h再灌注10 min、1 h、2 h、4 h、6 h和12 h组。对照组除结扎、再灌注操作外，其余操作同模型组。模型组10%水合氯醛按3 mL/kg腹腔注射麻醉小鼠，采用套扎钳及橡皮圈结扎双后肢根部使双后肢缺血2 h，然后剪断橡皮圈并对小鼠双侧后肢进行按摩，进行血流灌注。分别于再灌注10 min、1 h、2 h、4 h、6 h和12 h后进行心脏取血及主动脉的剥离，留取血清及主动脉标本进行各指标的测定。

3.2激光多普勒血流仪测定血流值动物麻醉后将其仰卧固定于37 ℃恒温操作台上，将激光多普勒血流仪的探头固定于右后肢脚掌上，PSW软件记录并分析各组小鼠肢体血流变化情况。

3.3颈动脉插管法监测血压动物麻醉后将其仰卧固定于手术台上，沿气管作颈正中切口，在体视显微镜下沿胸锁乳突肌钝性分离一侧颈总动脉。颈总动脉远心端用手术缝线结扎，近心段用颈动脉夹夹闭。在颈总动脉上剪一“V”型切口，将充满浓度为15 IU/mL的肝素溶液的自制动脉导管插入颈总动脉并固定。松开颈动脉夹，待动物稳定10 min后，开始进行血压实时监测。

3.4离体组织灌流系统测定血管收缩反应性小鼠处死后，分离主动脉，置入预冷K-H液中冲洗，将其于培养皿中固定。显微镜下去除主动脉周围结缔组织，选取4个位置，制成长约2 mm的动脉环标本。在离体微血管张力测定仪的浴槽中注入5 mL的K-H液，用直径约40 μm、长度3 cm左右的金属丝固定血管环于传感器的钳口内，钢丝平直并使血管保持一定的张力，持续通入95%的氧气与5%的CO2混合气体，维持温度在37 ℃。对仪器进行标准化，调节最适初张力至PowerLab Chart自动给定的数值。血管环休息30 min，期间每15 min更换1次K-H液。用60 mmol/L的KCl溶液刺激血管环收缩，其达到平值后记录收缩幅度，重复上述步骤3次，若所得收缩幅度大于1 mN，且两次数值相差小于10%，说明血管活性保持良好，可以进行下一步实验。用10-6mol/L的ACh检测内皮功能，若舒张幅度大于80%，说明内皮完整性保持良好，可以进行下一步实验。血管于K-H中平衡1 h后，分别以10-9mol/L、3×10-9mol/L、10-8mol/L、3×10-8mol/L、10-7mol/L、3×10-7mol/L、10-6mol/L、3×10-6mol/L、10-5mol/L和3×10-5mol/L的NE每2 min刺激主动脉血管环，期间不洗脱，记录血管环的收缩情况并制作收缩反应曲线。

3.5血管HE染色及超微结构的观察小鼠处死后将主动脉置于10%中性甲醛固定液中固定24 h，常规组织学切片处理。采用数字切片扫描系统进行图像采集，高倍镜下(×400)每组切片随机选取20个视野，根据文献进行血管损伤评分。评分标准如下[6]：0分，内弹力膜完整；1分，内弹力膜破裂；2分，中层弹力膜破裂；3分，外弹力膜破裂。各组另取3只小鼠主动脉制成长约1.5 mm的血管环标本，置于预冷的2.5%戊二醛固定，常规电镜切片处理，用枸橼酸铅及醋酸铀染色，H-7650透射电子显微镜(HITACHI)下观察组织。

3.6蛋白免疫印迹技术检测AT1受体、Mas受体、ACE和ACE2的蛋白水平 每组称取50 mg的血管，剪碎后加入300 μL组织裂解液，冰上电动匀浆。12 000 r/min低温离心15 min，取上清分装。采用BCA法测定血管匀浆的蛋白浓度，并调整蛋白浓度至3 g/L。取20 μL蛋白溶液与5×上样缓冲液混匀，煮沸10 min后SDS-PAGE电泳，醋酸纤维素膜转膜，封闭液封闭1 h后于提前配好的 I 抗内孵育过夜(AT1受体 1∶200，Mas受体 1∶200，ACE 1∶500，ACE2 1∶500，GAPDH 1∶1 000)。TBST洗膜3次，每次10 min。放入相应的Ⅱ抗溶液(1∶1 000)37 ℃孵育1 h，TBST漂洗3次，每次10 min。将条带涂抹ECL发光剂后置于全自动图像分析仪暗盒内，设置曝光时间，自动成像。采用ImageJ软件分析条带。

3.7ELISA法测定血清中AngⅡ和Ang(1-7)的含量将所取血液室温静置2 h，4 ℃离心机中4 000 r/min离心10 min，取上清。按试剂盒说明进行操作，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度，同时绘制标准曲线，计算样品浓度。

4统计学处理

采用SPSS 17.0进行统计学分析，所得结果以均数±标准差(mean±SD)表示。符合正态分布的计量资料采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，选用Dunnett-t检验比较时间组与对照组间差异；不符合正态分布的计量资料采用秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1激光多普勒血流仪测定的血流值

与对照组相比，模型组小鼠肢体结扎后血流值大幅度下降，几乎全部被阻断(P<0.05)；肢体解套扎后，血流值有所回升，当再灌注2 h与再灌注4 h时血流值缓慢回升，与对照组无显著差异；随着再灌注时间的延长，再灌注6 h后血流值下降(P<0.05)，见图1。

2颈动脉血压测定结果

因对照组未经缺血处理，血压保持稳定；模型组在缺血期间，血压虽有所下降但程度不明显；再灌注10 min血压出现明显回升，基本达到缺血前水平；再灌注10 min后，随着再灌注时间的延长，模型组血压逐渐下降，且下降程度明显(P<0.05),见图1。

Figure 1.The changes of blood flow ratio and mean arterial pressure (MAP) at different time points. TS: tourniquet shock.Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

图1不同时点血流和血压变化

3血管反应性测定结果

各血管在10-9mol/L、3×10-9mol/L和10-8mol/L浓度NE刺激下均无明显收缩；对照组的血管在3×10-8mol/L浓度以上NE刺激下随着NE的浓度升高，其收缩百分比逐渐升高；而模型组在3×10-8mol/L和10-7mol/LNE刺激的下血管收缩百分比随着去甲肾上腺素的浓度的升高而升高，超过3×10-7mol/L浓度后，血管收缩百分比反而随着NE浓度的升高而降低；再灌注10 min组对于NE的收缩反应性高于其它模型组，甚至在10-7mol/L和3×10-7mol/L 浓度NE的刺激下，其收缩幅度高于对照组，但差异无统计学显著性；其余各模型组对于NE的反应性在各个浓度均低于对照组(P<0.05)，再灌注4 h组的血管反应性最低，见图2。

Figure 2.The changes of vascular reactivity at different time points. Mean±SD.n=6.

图2不同时点血管反应性变化

4血管损伤的形态学变化

光学显微镜下，对照组血管内壁光滑，管腔规整，内皮细胞排列整齐，各层弹力膜薄厚均匀，连续性好；再灌注10 min组血管未见明显损伤；其余各模型组血管均有不同程度的损伤，表现为血管管腔不规整，内膜粗糙，内皮细胞不完整，弹力纤维断裂，各弹力纤维间排列疏松，薄厚不均，部分甚至形成团块状凸向管腔。随着再灌注时间的延长，损伤评分逐渐升高,见图3。

Figure 3.Vascular injury at different time points (HE staining，×400). Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

图3不同时点血管损伤情况

电子显微镜下，对照组内皮细胞扁平，细胞之间排列紧密，细胞核呈椭圆形，核内染色质均匀，胞质内可见粗面内质网及线粒体，内弹力膜排列规整，膜下可见平滑肌细胞及排列整齐的弹力纤维；再灌注10 min组血管损伤不明显；其余模型组损伤较明显，主要表现为内皮细胞呈柱状，排列不规则，胞间部分紧密连接消失，胞内胞质深染，细胞器模糊，线粒体肿胀，可见空泡或嵴断裂，粗面内质网减少，内弹力膜粗细不均，平滑肌细胞、纤维组织增生,见图4。

Figure 4.The images of transmission electron microscopy at different time points.

图4不同时点透射电镜的观察结果

5RAS成分测定结果

5.1AT1受体/Mas受体和ACE/ACE2测定结果AT1受体在对照组表达最高，再灌注10 min开始降低，但差异无统计学显著性；随着再灌注时间的延长，AT1受体蛋白的表达逐渐降低(P<0.05)；而Mas受体在对照组表达最低，再灌注10 min组虽然有所升高，但差异无统计学显著性；随着再灌注时间的延长，Mas受体蛋白表达逐渐升高(P<0.05)，再灌注12 h时表达最高,见图5。

Figure 5.The protein expression of vascular AT1 receptor/Mas receptor at different time points. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol (C) group (0 h).

图5不同时点血管AT1受体/Mas受体的蛋白表达

ACE在对照组表达最低，在模型组中随着再灌注时间的延长表达逐渐升高，再灌注10 min组与再灌注1 h组升高不明显，其余模型组升高显著(P<0.05)；ACE2在对照组表达最高，在模型组中随着再灌注时间的延长表达逐渐降低，差异显著(P<0.05)，再灌注12 h组表达最低,见图6。

5.2AngⅡ和Ang(1-7)测定结果与对照组相比，模型组AngⅡ的含量增高，除再灌注10 min模型组外，其余模型组增高均比较明显(P<0.05)，12 h组含量最高；而Ang(1-7)的含量在对照组表达最高，在模型组各组表达均降低，差异有统计学显著性(P<0.05)，12 h组含量最低,见图7。

Figure 6.The protein expression of vascular ACE/ACE2 at different time points. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol (C) group (0 h).

图6不同时点血管ACE/ACE2的蛋白表达

Figure 7.The content of serum AngⅡ/Ang(1-7) at different time points. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group (0 h).

图7不同时点血清AngⅡ/Ang(1-7)的含量变化

讨论

对于血管低反应性发生的机制，现有多种学说，例如一氧化氮及其继发性产物大量生成刺激血管引起血管舒张并通过激活多种机制介导血管低反应性的发生[7]；肾上腺素受体失敏及下调，即受体与配体亲和力下降或受体表达减少以及受体偶联酶活性降低或脱偶联等；钙超载及钙失敏，即血管平滑肌细胞肌肉收缩蛋白对钙的敏感性降低等。众多研究表明，休克后血管反应性呈双向变化，例如在脓毒性休克的代偿期血管反应性是短暂升高的，而失代偿期血管反应性下降明显，本实验采用的是离体组织灌流系统观察主动脉环对NE的反应性，其结果与脓毒性、失血性休克研究结果一致[8]。

失血性休克后肾素-血管紧张素-醛固酮系统与交感-肾上腺髓质系统被激活，引起循环系统内大量的儿茶酚胺及血管紧张素Ⅱ的释放[10]。本实验研究提示，止血带休克后同样存在肾素-血管紧张素系统的激活，且RAS系统表达明显失衡，推测其可能与血管低反应性的发生有关。

研究表明，内毒素休克中AT1受体相关蛋白表达下降，并介导了血管对AngⅡ的反应性降低[11]，一项研究结果证实AT1受体的减少较其它机制(如离子通道、NO、硝酸盐等)相比在血管低反应性的发生中更具重要性[12]。本实验发现，AT1受体的蛋白表达量随着休克时间的延长表达量逐渐降低，再灌注12 h组的表达量最低。受体表达量的降低，直接导致AngⅡ对血管的收缩作用减小，推测此为血管反应性下降的另一重要机制。

文献表明，Ang(1-7)与Mas受体的结合通过nNOS作用能介导NO的生成。Whitaker也指出，在失血性休克中，抑制Ang(1-7)与Mas受体的结合，能减少NO的产生[13]，说明Mas能诱导NO的生成。在血管低反应性的发生机制中，NO起重要作用，如NO可使血管平滑肌内的鸟苷酸环化酶激活，细胞内的cGMP浓度升高，环鸟苷酸-蛋白激酶G通路介导肌球蛋白轻链的去磷酸化，从而引起血管舒张。除此之外，NO还可通过激活cGMP-PKG通路进而开放大电导钙依赖性钾通道引起细胞膜的超极化而导致血管反应性的降低，或者通过激活多聚-ADP核酶引起血管低反应性。本实验中Mas受体表达量随着休克时间的延长逐渐增加，其可以更好地与血清中Ang(1-7)结合生成NO，进而介导血管低反应性的发生。

本实验室前期研究[4-5]发现，在止血带休克中，随着休克时间的延长，肾脏以及肺组织中的ACE表达含量逐渐增高，ACE2的含量逐渐减少，血清中AngⅡ增加、Ang(1-7)减少。本实验中，随着休克时间的延长主动脉中ACE表达量逐渐增高，而ACE2的表达量逐渐降低，血清AngⅡ呈增高趋势，Ang(1-7)呈降低趋势，说明RAS轴失衡程度愈加明显。这与本实验室前期对于止血带休克后肾脏及肺的ACE/ACE2表达及血清AngⅡ、Ang(1-7)变化的实验研究结果一致。

综上所述，止血带休克后出现明显的RAS系统失衡，其与血管低反应性的发生可能有关。

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(责任编辑： 林白霜， 罗森)

Changes of aortic contractile reactivity and RAS components after tourniquet shock

WANG Li-jun1, WANG Jian-hui1,WANG Yu-juan2, FAN Su-jing1, ZHU Li-yan1, YANG Xiu-hong1

(1DepartmentofPhysiology,SchoolofBasicMedicalSciences,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology，2NinthHospitalofTangshan,Tangshan063000,China.E-mail:ljkyxhljn@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the role of renin-angiotensin system (RAS) disequilibrium in hyporeactivity and injury of aorta after tourniquet shock (TS) by observing the changes of aortic contractile reactivity and RAS components after TS. METHODS: Male C57BL/6 mice (8 months old) were divided into 7 groups including control group and 6 model groups. The mice in model groups were sacrificed at reperfusion of 10 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h and 12 h. The mice in control group were not subjected to tourniquet ligation. The Doppler flowmetry was used to determine the limb blood flow. The carotid artery catheter was applied to detect the blood pressure. The isolated vascular tension tester was available to measure the reactivity of the aorta. HE staining combined with transmission electron microscopy was used to evaluate the morphology of injured aortas. The protein expression of AT1 receptor, Mas receptor, ACE and ACE2 was measured by Western blot. The serum contents of Ang Ⅱ and Ang (1-7) were detected by ELISA. RESULTS: Compared with control group, the blood flow in model groups decreased gradually with the prolongation of reperfusion time. The blood pressure increased at 10 min after reperfusion, and then decreased gradually. Accordingly, vascular reaction to norepinephrine (NE) increased at 10 min and then descended. The vascular reactivity reached the lowest level at 4 h. Morphological injury score increased gradually. Vascular AT1 receptor and ACE2 proteins were reduced, while Mas receptor and ACE proteins were up-regulated compared with control group. The content of Ang Ⅱ in the serum elevated, while the content of Ang (1-7) was reduced. CONCLUSION: The mechanism of aortic reaction to NE increased temporarily in the early stage of shock and then decreased. It may be related to the morphological injury of aorta and the imbalance of RAS.

[KEY WORDS]Tourniquet shock; Aorta; Vascular contractile reactivity; Renin-angiotensin system

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.004

[中图分类号]R363

[文献标志码]A

通讯作者△Tel： 0315-3726387； E-mail: ljkyxhljn@163.com

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No. 81372029)；河北省自然科学基金资助项目(No. H2012401015)；唐山市科学技术研究与发展计划(No.10150204A10； No.12130266b)

[收稿日期]2015- 06- 01[修回日期] 2015- 12- 03

[文章编号]1000- 4718(2016)03- 0405- 06

杂志网址： http://www.cjpp.net