趋化素样因子1在大鼠腹主动脉瘤病情发展中的作用

庄　晖　郭平凡　詹腾辉

(福建医科大学附属第一医院血管外科，福建　福州　350005)



趋化素样因子1在大鼠腹主动脉瘤病情发展中的作用

庄晖郭平凡詹腾辉

(福建医科大学附属第一医院血管外科，福建福州350005)

〔摘要〕目的探讨氢气抑制趋化素样因子1(Cklf1)在大鼠腹主动脉瘤病情发展中的作用。方法取雄性SD大鼠20只，随机分为腹主动脉瘤组和腹主动脉瘤干预组(腹腔注射氢气饱和生理盐水)，建立腹主动脉瘤模型。术后28 d开腹取材，观察腹主动脉扩张情况，采用苏木素-伊红(HE)染色和弹力纤维染色检测炎症浸润和腹主动脉中膜弹力纤维破坏情况，免疫组化法检测Cklf1(rCklf1)、金属蛋白酶(MMP2)蛋白表达情况，RT-PCR检测rCklf1、MMP2基因表达情况。结果腹主动脉瘤组大鼠腹主动脉扩张率明显高于腹主动脉瘤干预组(P<0.01)。腹主动脉瘤组大鼠瘤壁rCklf1 mRNA、MMP2 mRNA表达量均明显高于腹主动脉瘤干预组(P<0.01)；rCklf1、MMP2主要在腹主动脉瘤壁中层病变严重区域表达上调；与腹主动脉瘤组相比，干预组rCklf1、MMP2阳性表达明显减弱，炎症浸润、弹力纤维破坏程度明显减轻。结论氢气可通过抑制rCklf1表达，抑制炎性细胞向腹主动脉受损区域聚集，降低MMP2表达合成，减缓中膜弹力纤维降解，干预腹主动脉瘤进展。

〔关键词〕腹主动脉瘤；趋化素样因子1

腹主动脉瘤为老年性疾病之一，多数在动脉硬化基础上发生。趋化素样因子1(Cklfl)具有趋化因子的结构特征和功能。相关研究显示，腹主动脉瘤体组织中趋化因子表达明显增强，在病情进展中能够准确调控白细胞向炎性组织迁移〔1〕。已有研究显示，氢气可成为一种新的治疗炎性疾病的特效药物，其主要机制为抑制趋化因子表达〔2〕。本研究拟探究大鼠Cklfl(rCklf1)在受氢气饱和生理盐水干预后对腹主动脉瘤进展的影响。

1 材料与方法

1.1动物与试剂SPF级雄性SD大鼠，购于北京华阜康生物科技股份有限公司；氢气饱和生理盐水购于济南红杉树健康科技有限公司；兔源rCklf1多克隆抗体由中国医科大学赠予；兔源基质金属蛋白酶(MMP)2购于上海钰博生物科技有限公司；Trizol试剂购于江苏溥博生物科技有限公司；逆转录酶、TaqDNA聚合酶、通用引物Oligo(dT)Primer购于赛默飞世尔科技有限公司；引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

1.2方法①实验分组：取雄性SD大鼠20只，体质量190～210 g，根据体质量编号，随机分为腹主动脉瘤组和腹主动脉瘤干预组，每组10只。其中腹主动脉瘤干预组大鼠腹腔注射氢气饱和生理盐水6 ml·kg-1·d-1；腹主动脉组大鼠腹腔注射等量的生理盐水；上述注射操作从造模成功日起到取动脉瘤组织日结束，注射1次/d。②建模和标本采集：腹主动脉瘤模型建立完全按照Lenburg等〔3〕研究的方法。从造模成功后第28天，打开大鼠腹腔，分离腹主动脉段，取其中一半长度置于4%甲醛溶液中固定，进行苏木素-伊红(HE)染色、免疫组化染色、特殊染色。余下的另一半置于-80℃冰箱中，用于RT-PCR检测。③指标检测：腹主动脉直径测量完全按照Chiou等〔4〕研究方法；rCklf1和MMP2 mRNA相对定量检测中RCR引物：rCklf1上游引物：5′ACGCCGCGCCTCCCAGAATT3′；下游引物：5′ACGAGAGGTCCTGAGCGCGT3′。MMP2上游引物：5′CGACTATGACTGTGACCATGAC3′；下游引物：5′GTTAGAAAAGACCCTCGAGATG3′。

1.3统计学分析采用SPSS18.0软件进行t检验及Pearson相关分析。

2结果

2.1大鼠腹主动脉瘤大体形态造模后大鼠腹主动脉最大直径较造模前增加50%以上可诊断为腹主动脉瘤，本研究两组大鼠均达到该诊断标准，成瘤率100%。腹主动脉瘤组大鼠腹主动脉扩张率为(163±34)%，明显高于腹主动脉瘤干预组大鼠的(85±39)%(t=18.299，P=0.000)。

2.2HE染色和弹力纤维染色HE染色显示腹主动脉瘤组大鼠动脉血管壁结构破坏、厚度增加，平滑肌细胞排列不整，多数炎性细胞浸润；腹主动脉瘤干预组大鼠动脉血管壁结构完整、厚度无明显改变，平滑肌分布整齐，炎性细胞数量明显多于腹主动脉瘤组。弹力纤维染色显示，腹主动脉瘤组大鼠动脉中膜弹力纤维层次不清，形态无规律，层数减少，存在碎片、断裂，无原有的连续性和曲度；腹主动脉瘤干预组大鼠弹力纤维总体结构较为完整，层次清晰，连续性和曲度较好，见图1，图2。

2.3免疫组化染色分别进行免疫组化rCklf1、MMP2特异性蛋白染色，腹主动脉瘤组大鼠动脉瘤组织结构显示强阳性棕黄色染色，rCklf1、MMP2高表达多分布在动脉瘤管壁中层碎片、断裂等病变严重区域；腹主动脉瘤干预组rCklf1、MMP2表达均呈现弱阳性，见图3、图4。

图1　术后28 d两组腹主动脉HE染色(×400)

图2　术后28 d两组腹主动脉弹力纤维染色(×400)

图3　术后28 d两组腹主动脉rCklf1染色(×400)

图4　术后28 d两组腹主动脉MMP2染色(×400)

2.4RT-PCR检测结果rCklf1 mRNA在腹主动脉瘤组动脉瘤组织中相对含量(4.90±0.47)明显高于腹主动脉瘤干预组(1.45±0.30)(t=18.399，P=0.000)；MMP2在腹主动脉瘤组动脉瘤组织中相对含量(11.39±0.52)明显高于腹主动脉瘤干预组(3.57±0.86)(t=16.359，P=0.000)。rCklf1 mRNA与MMP2 mRNA变化之间呈明显正相关(r=0.840，P=0.006)。

3讨论

炎症参与了腹主动脉瘤发病，其中趋化因子调控淋巴细胞和单核巨噬细胞的活化、转移是启动腹主动脉瘤发病的关键〔5〕。相关研究发现，腹主动脉瘤血管组织中趋化因子明显高表达，在趋化因子的引导下血液中淋巴细胞和巨噬细胞浸润于动脉血管壁，分泌出大量MMP，促使动脉管壁中包括胶原蛋白、弹力蛋白等在内的结构蛋白降解，损伤胶原纤维和弹力纤维，其中弹力纤维受损在腹主动脉瘤形成过程中具有重要地位〔6,7〕。Cklfl在体内和体外均对淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞有明显的趋化活性，与动脉硬化、内膜增生等炎症进程有明显关联。考虑到Cklfl的特殊结构和功能，我们推测Cklfl可能参与了腹主动脉瘤发病。氢气对所有严重相关疾病均具有较好的疗效，主要机制为抑制趋化因子的表达。在内毒素诱导急性肺损伤大鼠中，氢气可通过下调趋化因子表达，来缓解组织中炎性细胞聚集，减轻炎症对机体组织的伤害〔8〕。

本文提示，在腹主动脉瘤形成早期可采用药物、基因等治疗手段抑制Cklfl的表达，还可使用Cklfl受体竞争性抑制剂来干预动脉瘤的形成过程。此外，氢气能够有效干预腹主动脉瘤进程，在伦理委员会批准后，可进行多中心试验来验证氢气抑制腹主动脉瘤。临床上对于瘤体直径>5.5 cm的大腹主动脉瘤，应尽早行动脉瘤切除术治疗；但80%以上的腹主动脉瘤直径<5.5 cm，外科手术治疗风险高于收益，对于此类患者只能通过定期随访检测瘤体变化，待直径>5.5 cm时给予手术治疗。

4参考文献

1郑梓煜，叶子，黄应雄，等.腹主动脉瘤破裂的预后影响因素分析〔J〕.中华急诊医学杂志，2014；23(11)：1253-8.

2王宏颖，包学英，王璐，等.肠癌患者肠道菌群中大肠埃希菌携带β-葡萄糖醛酸酶基因的鉴定与特征〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2015；16(3)：332-4.

3Lenburg JC，Simioneseu DT，Stareher BC，etal.ElastJn stabilization for treatment of abdominal aortic aneurysms〔J〕.Circulation，2007；115(23)：1729-37.

4Chiou AC，Chiu B，Pearce WH.Murine aortic aneurysm produced by periarterial application of calcium chloride〔J〕.J Surg Res，2001；99(11)：371-6.

5屈碧辉，蔡威，何涛，等.腹主动脉瘤患者外周血CD19+CD24 hi CD38 hi B细胞功能变化〔J〕.中国老年学杂志，2015；35(14)：3841-3.

6裴华伟，常谦.间充质干细胞在腹主动脉瘤治疗应用中作用机制的研究进展〔J〕.中国循环杂志，2014；29(8)：653-5.

7Zhang Y，Sun Q，He B，etal.Anti-inflammatory effect of hydrogen-rich saline in a rat model of regional myocardial ischemia and reperfusion〔J〕.Int J Cardiol，2011；148(39)：91-5.

8李靖华，林晓东，粟海霞，等.腹主动脉瘤与CD40的关系〔J〕.中华实验外科杂志，2015；32(2)：271-3.

〔2015-07-10修回〕

(编辑李相军/滕欣航)

〔中图分类号〕R65

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)06-1287-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.06.003

基金项目：福建省自然科学基金(No.2014J01323)

第一作者：庄晖(1978-)，男，硕士，主治医师，主要从事下肢血管疾病、内脏血管疾病、主动脉疾病及血管畸形研究。