全新长链非编码RNA IRAIN在乳腺癌中的表达及意义

关艳杰　宋艳秋　徐晓恒　王晓萌　康丽花

(吉林大学第一医院肿瘤中心，吉林　长春　130021)



全新长链非编码RNA IRAIN在乳腺癌中的表达及意义

关艳杰宋艳秋徐晓恒王晓萌康丽花

(吉林大学第一医院肿瘤中心，吉林长春130021)

〔摘要〕目的探讨一种全新的长链非编码RNA IRAIN 在正常乳腺组织及各分子亚型乳腺癌组织的表达水平及特点。方法半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)确定IRAIN mRNA是否表达于乳腺癌组织中；应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应 (qRT-PCR)方法检测IRAIN mRNA和胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)mRNA在正常乳腺组织及不同分子亚型乳腺癌组织的表达水平及特点；应用链方向特异性 RT-PCR(SSRT-PCR)绘制 IRAIN 转录方向；用DNA测序方法分析冰冻人乳腺癌组织中IRAIN SNP位点(rs8034564)杂合状态及等位基因表达特点，明确该基因是否呈单等位印记表达。结果与正常乳腺组织相比，各分子亚型乳腺癌中IRAIN表达均降低，其中以三阴性乳腺癌降低最为明显，人表皮生长因子2(HER2)阳性型乳腺癌IRAIN表达也明显低于正常乳腺组织(P<0.05)。Luminal型同样低于正常乳腺组织，但无统计学意义(P>0.05)。而对后三者做两两比较，无统计学意义(P>0.05)。IGF-1R在预后最好的Luminal型中表达最高，与正常乳腺组织接近，而在预后差的TNB型和HER2阳性型表达明显低于正常乳腺组织及Luminal型(P<0.05)。对TNB型和HER2阳性型两者做比较，无统计学意义(P>0.05)；IRAIN转录方向与IGF-1R mRNA 的方向相反，是IGF-1R的反义长链非编码RNA；IRAIN在人乳腺癌组织中呈单等位基因表达，且呈单等位基因不均衡表达。结论IRAIN是IGF-1R基因的反义长链非编码RNA，在人乳腺癌组织中呈单等位基因不均衡表达，可能作为抑癌基因，调控肿瘤细胞生长。

〔关键词〕乳腺癌；胰岛素样生长因子1受体；长链非编码RNA

胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)信号转导通路涉及乳腺癌的发生、发展、转移及治疗耐药等多方面，在乳腺癌中表达高频率失调，具体机制尚不清楚。长链非编码RNA(LncRNA)是一类长度超过200 nt的RNA，其本身不编码蛋白质，但并不是“非功能”RNA，而是在多种层面上调控基因的表达水平，广泛参与包括生长、分化、发育及凋亡在内的几乎所有生理或病理过程。课题组导师国际上首次在IGF-1R基因区发现一条全新的长链非编码RNA，命名为IRAIN。鉴于IGF-1R通路在乳腺癌中的重要地位及IRAIN处于IGF-1R基因区这一事实，我们推测IRAIN在乳腺癌的发生、发展中扮演一定角色，然而IRAIN在乳腺癌领域的研究尚属空白状态。本研究将重点关注IRAIN在乳腺癌中的表达特点及作用机制，为寻找对乳腺癌有预测、预后价值的生物标记物及个体化的乳腺癌治疗靶点提供理论基础和实验依据。

1资料与方法

1.1标本采集收集2009年1月至2011年12月吉林大学第一医院病理确诊的未经化疗和放疗的原发性浸润性乳腺癌组织74例，年龄28~77(中位54)岁；绝经者35例；肿瘤大小0~2 cm 18例，2~5 cm 52例，>5 cm 4例；分化程度良好2例，中等39例，差33例；脉管癌栓阳性者40例，腋窝淋巴结阳性者34例；雌激素受体(ER)阳性31例；孕激素受体(PR)阳性28例；人表皮生长因子受体2(HER2)阳性27例；增殖指数(Ki67)<14%者12例。术中所取标本立即由组织标本库工作人员用液氮冷冻，随后所有组织-80℃冰箱保存。乳腺癌病理学诊断依照WHO肿瘤分类及诊断标准，分期根据美国癌症联合委员会AJCC乳腺癌TNM分期，分级采用Nottingham联合组织学分级。ER、PR、HER2及Ki67通过免疫组化的方法检测。如免疫组化结果显示HER2阳性，我们将通过荧光原位杂交(FISH)方法进一步确定HER2是否过表达。根据2015年St.Gallen乳腺癌分子分型共识，我们将患者分为以下3组：①三阴性乳腺癌：即TNB型23例，ER和PR阴性，HER2阴性。②HER2阳性型：ER和PR阴性，HER2阳性20例。③Luminal型：包括Luminal A-like和Luminal B-like，共31例。Luminal A-like：ER和 PR阳性(PR≥20%)，HER2阴性，Ki67 低表达(<14%)；Luminal B-like (HER2阴性)：ER阳性，HER2阴性，以及至少下面一种条件：Ki-67≥14%，PR阴性，PR阳性低表达(<20%)；Luminal B-like (HER2阳性)：ER阳性，HER2阳性，任何 Ki-67，任何PR。

1.2实验方法

1.2.1实时荧光定量PCR(qRT-PCR)将新鲜冰冻乳腺癌组织进行匀浆处理，提取总RNA，采用逆转录试剂盒(Invitrogen公司，美国)进行逆转录。采用SYBR Green荧光染料掺入法，使用ABI7900实时定量PCR检测机器完成实验(96 孔)，结果使用 SDS2.3 软件系统分析。内参基因选用β-actin，为减小误差每份标本做3个孔，取其平均值，计算IRAIN和IGF-1R基因的平均阈值循环数(Ct)，结果分析采用目标基因与对照的相对表达量，分析方法利用2-ΔΔCt法。

1.2.2链方向特异性 RT-PCR(SSRT-PCR)设计成对的5′和3′端特异性寡核苷酸引物，以冰冻乳腺癌组织总RNA为模板用热稳定的ThermoScript逆转录酶(Thermo，美国)和特异性引物在60℃高温下逆转录，以获得方向特异性cDNA片段，接下来以SS-cDNA作为模板进行PCR，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测目的片段PCR扩增产物。

1.2.3测序分析IRAIN 单等位基因表达使用SNP 位点(SNP#rs8034564，A/G)来区分亲本来源的两条等位基因。提取冰冻人乳腺癌组织标本基因组DNA(gDNA)SNP 位点(SNP#rs8034564，A/G)设计引物，进行PCR 反应，将产物测序，如果该位点为杂合子A/G，继续提取该标本mRNA，并逆转录为cDNA，PCR后测序，比对测序结果，明确是否存在单等位基因表达现象。

1.3统计学方法采用GraphPad Prism 5绘制各种分子亚型乳腺癌中IRAIN和IGF-1R基因表达图，采用SPSS19.0软件非参数秩和检验。

2结果

2.1IRAIN和IGF-1R在各分子亚型乳腺癌及正常乳腺组织的表达与正常乳腺组织相比〔2.763(0.925 6,13.2)〕，各分子亚型乳腺癌中IRAIN表达均降低，其中以三阴性乳腺癌降低最为明显〔0.494 9(0.132 5，1.377)，P=0.007〕，HER2阳性型乳腺癌IRAIN表达也明显低于正常乳腺组织〔0.727 7(0.231 4，3.572)，P=0.034〕。Luminal型同样低于正常乳腺组织，但无统计学意义〔1.164(0.321 2，2.447)，P=0.089〕。而对后三者做两两比较，TNB型与HER2阳性型(P=0.433)、TNB型与Luminal型(P=0.061)及HER2阳性型与Luminal型(P=0.322)之间均无统计学意义。IGF-1R在预后最好的Luminal型中表达最高〔2.060(1.305,5.575)〕，与正常乳腺组织接近〔1.936(1.041,2.710)〕，而在预后差的TNB型〔0.591 2(0.403 2,1.166)〕和HER2阳性型〔0.405 3(0.194 9,0.722 5)〕表达明显低于正常乳腺组织及Luminal型(P<0.05)。对TNB型和HER2阳性型做比较，无统计学意义(P=0.081)。

2.2IRAIN 方向分析选取IRAIN 基因上两个不同位置，在多个乳腺癌患者组织上应用SSRT-PCR方法确定IRAIN转录方向，其结果均是一致的，IRAIN转录方向与IGF-1R mRNA 的方向相反，阐明IRAIN为IGF-1R的反义LncRNA。 见图2。

1~4：HER2阳性型；5~7：Luminal型；8~10：TNB型图1　IRAIN在乳腺癌组织中表达下调

(A)IGF-1R/IRAIN基因位点示意图，pIRAIN：IRAIN 启动子被反方向转录；pIGF-1R：IGF-1R 编码RNA 启动子被正向转录；(B) IRAIN LncRNA 是一反义LncRNA，使用5′端或3′端寡核苷酸合成链特异的cDNAs，以此为模板行PCR以决定IRAIN 转录方向 M：100 bp marker；input：SSRT-PCR前总RNA图2　IRAIN基因位SSRT-PCR图

2.3乳腺癌中IRAIN单等位基因表达共检测48例乳腺癌患者，其中18例SNP 位点为杂合子，均存在单等位基因表达，见图3。乳腺癌组织基因组为A/G 杂合子，但IRAIN在乳腺癌中表达单等位基因“A”和“G”。单等位基因呈不均衡表达，等位基因“A”优势表达，18例SNP位点为杂合子的患者中，16例(89%)表达等位基因“A”，只有2例(11%)表达等位基因“G”。

1~6：为个体样本；乳腺癌组织中IRAIN基因组DNA为A/G杂合子，但逆转录DNA中IRAIN只表达单等位基因A或G图3　IRAIN在乳腺癌组织中单等位基因表达

3讨论

本研究找到了一种全新的与乳腺癌的关系密切的LncRNA-IRAIN，在正常乳腺组织中IRAIN普遍高表达，而在浸润性乳腺癌组织中表达异常，呈普遍低表达，并且IRAIN mRNA在侵袭性最强、预后最差的三阴性乳腺癌中表达量最低。

我们的实验结果表明IGF-1R在预后最好的Luminal型中表达最高，与正常乳腺组织接近，而在预后差的TNB型和HER2阳性型表达明显低于正常乳腺组织及Luminal型。IGF-1R在预后最好的Luminal型中表达最高这一结果似乎与以前的体外研究观点相矛盾，他们认为IGF-1R表达会导致细胞转化及恶性肿瘤形成〔1〕。但该观点来自于转基因小鼠模型，可能与实际人体内状况有差别。也有一些研究〔2~5〕表明IGF-1R在分化好的ER表达的乳腺肿瘤中高表达，这与我们的研究结果一致。我们的IGF-1R表达在ER阳性与ER阴性乳腺癌中不同的论断是被一些体外实验所支持的：在ER阳性细胞系中IGF-1R和ER协同刺激细胞增殖〔6〕，但在ER阴性细胞系，刺激IGF-1R不能诱导细胞有丝分裂，但它的促迁移作用仍然存在〔7，8〕。循环血中IGF-1浓度升高被认为是女性发生乳腺癌的高危因素〔9，10〕，但最近对17项前瞻性研究的荟萃分析表明这种危险相关性仅局限于ER阳性的乳腺癌〔11〕。这些数据强烈的支持这样一个概念：IGF-1R在ER阳性的与ER阴性TNB型及HER2阳性型乳腺癌中生物学意义及预后意义是完全不同的。我们推测很可能IGF-1R高表达、ER阳性的Luminal型乳腺癌属于具有独特的生物学特性及良好预后的一大亚类，分化好的ER阳性乳腺癌尚可通过ER和IGF-1R信号通路保持生理性的生长控制。IGF-1R的表达特点提示在相对分化程度较高的乳腺肿瘤中，增殖同样需要IGF-1R。因此，同ER 相似，IGF-1R有可能成为分化程度高的乳腺癌治疗的有效靶点。这可能部分解释抗IGF-1R新药在乳腺癌临床试验中失败的原因。而在ER阴性的TNB型及HER2阳性型乳腺癌中肿瘤细胞发展到非IGF-1R依赖状态，IGF-1R赋予乳腺癌细胞最初始的转移能力，在其发展与演变过程中有其他致癌作用更强的基因的参与，我们的结果恰好为这些临床前研究提供了一致的充足的临床证据。

根据表达方向LncRNA可分为正义LncRNA、反义LncRNA、双向LncRNA。其中，反义LncRNA因其结构特殊而备受关注，它是生物体内一类与其他转录物序列互补的内源性转录物，可与互补的RNA通过碱基互补配对形成双链RNA。本结果表明 IRAIN 的表达与 IGF-1R mRNA 的方向相反，为反义LncRNA。它可以通过与其他RNA形成RNA互补双链、改变染色质重塑等形式调控靶基因的表达，并有可能在疾病发生中发挥独特的作用。另外根据作用部位的不同，反义LncRNA可分为两类：顺式反义LncRNA和反式反义LncRNA。IRAIN是位于15号染色体IGF-1R基因位点的反义转录物，属于顺式反义LnC RNA。根据重叠的相对方向和重叠程度，顺式反义LnC RNA又可分为：头对头重叠、尾对尾重叠和完全重叠3 种形式，本课题组另外研究人员已经绘制出IRAIN结构，起始于 IGF-1R 基因内含子 1，跨越 IGF-1R 启动子、外显子 1，全长5 366 bp，属于完全重叠形式，有可能 IRAIN 是通过转录碰撞或者与正义转录物竞争结合转录因子和(或)顺式调控元件(启动子)来影响正义转录物IGF-1R的表达。在乳腺癌组织中检测IGF-1R 和IRAIN的结果显示，IRAIN 表达与 IGF-1R 相比呈较低水平表达。同时，在侵袭性最强的三阴性乳腺癌患者中，IRAIN 表达水平最低，可能释放了这种“竞争性的转录抑制”，进而IGF-1R 基因被激活，最终细胞不受控制地生长、扩增、侵袭和转移，提示 IRAIN 可能作为一个抑癌基因在乳腺癌起着重要的作用。

一些基因存在优先表达一个等位基因的现象，即所谓的“单等位表达基因”。我们发现IRAIN这种非编码RNA在乳腺癌中呈单等位基因表达，更独特的是，IRAIN的单等位基因并不是随机的单等位基因表达，而是呈不平衡表达，IRAIN似乎更喜欢其中含“A”的等位基因的表达，即等位基因“A”优势表达。然而，目前还不清楚等位基因“A”的优势表达是否与这种非编码RNA的功能相关，未来我们将进一步开展有益的探索。

4参考文献

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〔2015-12-31修回〕

(编辑曹梦园)

Expression and clinical significance of a novel long non-coding RNA IRAIN in breast cancer

GUAN Yan-Jie, SONG Yan-Qiu, XU Xiao-Heng,etal.

Tumor Center, the First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, Jilin, China

【Abstract】ObjectiveObjectives To explore the expression and characteristics of a novel LncRNA-IRAIN illustrated in normal breast tissues and different breast cancer molecular subtypes.MethodsIRAIN mRNA expression was confirmed in breast cancer tissue by semi quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR). IRAIN mRNA and IGF-1R mRNA were tested for the expression level and features in normal breast tissue and different breast cancer molecular subtypes by quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR). IRAIN transcription orientations were mapped by strand-specific RT-PCR (SSRT-PCR). Heterozygous state and allele expression features of IRAIN SNP site (rs8034564) were analyzed in frozen human breast cancer tissues with DNA sequencing approaches for confirming if the gene was monoallelic imprinting expressed.ResultsIRAIN expression was low in all molecular subtypes. Among them, the triple negative breast cancer became the most prominent in the reduction of IRAIN expression, and the HER2 over-expression subtype also dropped considerably compared with the normal group. The differences were significant. The expression of IRAIN in Luminal subtype was also lower than that of the normal, but there was no significant difference. In pairwise comparison of the last three group suggested no significant difference (P>0.05). The expression of IGF-1R was the highest in Luminal subtype which had the best prognosis, and was close to that in the normal breast tissue, while in poor prognostic types such as TNB and HER2+, the expression was significantly lower than that of the normal group and Luminal group (P<0.05). The difference between TNB and HER2+ subtype was not significant (P>0.05). The transcription orientation of IRAIN was the opposite to that of IGF-1R mRNA. IRAIN was transcribed antisense to IGF-1R in breast cancers and was monoallelicly expressed in cancer tissues. However, it was interesting to note the expression of the "A" allele was favored over the "G" allele.ConclusionsIRAIN is transcribed antisense to IGF-1R and monoallelicly expressed in breast cancer tissue, unequally. IRAIN could be treated as antioncogene to regulate the growth of tumor cells.

【Key words】Breast cancer; Insulin-like growth factor 1 receptor; Long noncoding RNA

〔中图分类号〕R73

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)05-1029-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.003

通讯作者：康丽花(1977-)，女，主治医师，医学博士，主要从事乳腺癌非编码RNA方面的研究。

基金项目：国家自然科学基金青年基金资助课题(81502277)

第一作者：关艳杰(1990-)，女，在读硕士，主要从事乳腺癌的靶向治疗研究。