FeCl3溶液诱导葡萄愈伤组织白藜芦醇积累及其与氧化应激的关系

李月荣，李荣飞，张 波,2，李迪迪，王晓琴

(1.石河子大学药学院，新疆石河子 832002；2.省部共建新疆特种资源植物药重点实验室，新疆石河子 832002)

FeCl3溶液诱导葡萄愈伤组织白藜芦醇积累及其与氧化应激的关系

李月荣1，李荣飞1，张 波1,2，李迪迪1，王晓琴1

(1.石河子大学药学院，新疆石河子 832002；2.省部共建新疆特种资源植物药重点实验室，新疆石河子 832002)

【目的】研究葡萄白藜芦醇的诱导剂，为开发新的葡萄保鲜剂与农药提供参考。【方法】采用FeCl3水溶液对红地球葡萄叶片愈伤组织进行诱导，应用HPLC分析愈伤组织中白藜芦醇的含量变化，DAB染色法检测活性氧水平，使用RT-PCR方法分析茋合酶基因(STS)的表达量变化。【结果】FeCl3溶液对葡萄愈伤组织茋类物质具有显著的诱导作用，诱导白藜芦醇的积累呈现显著的量时依赖性；1.6 mM FeCl3溶液处理18 h后愈伤组织中白藜芦醇含量可提高约8.5倍，鲜重达到210.8 μg/g。FeCl3溶液处理组的活性氧水平均高于对照组；加抗氧化剂CAT和NAC可明显降低FeCl3对白藜芦醇诱导效果。【结论】FeCl3溶液对红地球葡萄叶愈伤组织白藜芦醇积累具有显著升高作用，其积累机制与FeCl3所导致的氧胁迫正相关。

白藜芦醇；FeCl3溶液；愈伤组织；氧化应激

0 引 言

【研究意义】白藜芦醇(Resveratrol，缩写Res)又称茋三酚，存在于葡萄、虎杖、桑葚、花生等植物中，是一种植保素。葡萄叶片中白藜芦醇含量较低，仅为0.06～46 μg/g鲜重，作为植保素，葡萄在真菌感染、干旱、盐碱或其他氧化胁迫条件下白藜芦醇含量会升高。可以基于以上研究成果寻找一种有效、绿色、廉价的诱导剂用于葡萄植株的病害预防或葡萄的保存。【前人研究进展】目前已有报道可以升高葡萄材料白藜芦醇的非生物诱导剂有UV[1-3]、CO2[4]、臭氧[5]、H2O2[6]、乙磷铝[7]、氯化铝[8]、CuSO4[9]、茉莉酸甲酯[10]、水杨酸[11]等，同时也有研究报道表面活性剂SDS、TX-100可显著增加H2O2的诱导作用[12]。课题组前期研究发现，葡萄叶片材料白藜芦醇含量与其所处氧化胁迫状态密切相关[2,13]，但叶片材料对液体诱导剂吸收相对局限，所用诱导剂如铝剂毒性过大，限制了其在果实保藏上的应用。现有的植物营养元素中，在滴水观音的营养液中加入过量的 FeCl3溶液之后，会对滴水观音造成有效的氧化胁迫[14]。FeCl3又属于低毒性的化学试剂，而葡萄愈伤组织所处环境易控制，底物含量低等，研究铁剂对葡萄叶片愈伤组织的诱导更有意义。【本研究切入点】前人研究已表明FeCl3溶液可以对某些植物造成氧化胁迫，而对于葡萄来说，氧化胁迫是一种有效升高其白藜芦醇含量的方法。【拟解决的关键问题】以红地球葡萄叶片愈伤组织为材料，研究FeCl3溶液是否会对葡萄愈伤造成氧化胁迫，从而使白藜芦醇含量升高。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 红地球葡萄

红地球葡萄(VitisviniferaL. cv. Red Globe)由新疆石河子葡萄研究所提供，于石河子大学药园培育(25℃)；选择顶端的嫩叶作为外植体材料。

1.1.2 试剂

白藜芦醇标准品(纯度≥99%，美国Sigma-Aldrich公司)，过氧化氢酶(Catalase，缩写CAT，美国Sigma-Aldrich公司)，N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl cysteine，缩写NAC，美国Sigma-Aldrich公司)； 3,3'-二氨基联苯胺(3,3'-diaminobenzidine,缩写DAB，北京索莱宝公司)；乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)；其余试剂均为分析纯，稀释及空白处理中的水为实验室制备双蒸水。

1.2 方 法

1.2.1 葡萄外植体的处理及诱导

以红地球葡萄顶端嫩叶作为外植体材料诱导愈伤组织。采用B5培养基附加1 mg/L 的2,4-D(2,4一二氯苯氧乙酸)，1 mg/L 的6-BA(6-苄基氨基嘌呤)，2%蔗糖和0.6%琼脂，pH值在3.2～5.7，于121℃高压灭菌30 min。培养温度为(25±1)℃，无光照培养。每20 d继代一次，取继代三次后白色、蓬松、完整的愈伤组织作为实验材料，并用相机(Canon EOS 400D，日本)及显微镜(Zeiss Primo Star，德国 )拍照。愈伤组织的诱导和继代均采用无菌操作。图1

A：红地球葡萄叶片;B：宏观状态；C:微观状态(400×)

A：the leaves ofVitisviniferaL.cv.Red Globe;B：macroscopic state；C： microstate(400×)

图1 白色愈伤组织来源(红地球葡萄叶片)

Fig. 1 The sources of white callus

1.2.2 FeCl3处理葡萄叶片愈伤组织

选用分别为0、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0 mM不同浓度的FeCl3溶液于10 mL离心管中浸泡处理愈伤组织，置于25 ℃恒温箱中，暗孵育18 h；以及使用1.6 mM的FeCl3溶液分别暗孵育0、6、12、18、24、30、36、42和48 h；每个处理重复3次。处理完毕，离心，弃上清，将愈伤倒在干净的培养皿中，用滤纸吸去愈伤中的水，称重。抗氧化剂的处理方式为在暗室中浸泡处理2 h[15]，CAT的浓度为1 000 U[16]， NAC的浓度为1 mmol/L[17]。表1

表1 抗氧化剂处理方式

Table 1 Antioxidants treatments

叶片编号蒸馏水处理(h)CAT前处理(h)NAC前处理(h)FeCl3处理(mM)暗室放置(h)120001822001 61830201 61840021 618

1.2.3 Z DAB染色

称取0.1 g的愈伤组织，分别用0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mM的FeCl3溶液(以不加愈伤组织的相应浓度的FeCl3溶液作为相应处理组的对照)0.4 mL暗孵育12 h，加入1 mg/mL DAB溶液(溶于pH 3.8的Tris-HCl溶液)，黑暗条件下染色8 h，用酶标仪(Thermo 3001，美国)在390 nm处测定其吸光值，每个处理重复3次。其中△OD390=OD对照组-OD实验组。

1.2.4 白藜芦醇的提取和检测

将称重后的愈伤组织加适量甲醇，研磨，超声提取20 min，然后振荡离心，提取三次，再将上清液收集蒸干，干样品溶解于甲醇溶液中，用甲醇定容至10 mL容量瓶中。通过HPLC法对葡萄叶片中的白藜芦醇进行定量分析，方法参照文献[13]。上述操作均在避光条件下进行。用岛津Essentia LC-15C高效液相色谱仪(Shimadzu，日本)检测：将制备的样品(10 000×g)离心10 min，取上清液过有机膜(0.45 μm)，0.2%磷酸水过水膜(0.45 μm)。色谱条件：采用二元梯度洗脱，流动相A为乙腈，B为双蒸水(0.2%磷酸)，柱温25 ℃，进样量20 μL，流速1 mL/min，检测波长306 nm。色谱柱 Atlantis C18 (250 mm × 4.6 mm，5 μm， Waters公司 )。洗脱程序：0～4 min，80%～76% B；4～20 min，76%～69% B；20～25 min，69%～60% B。每个样品重复3次。白藜芦醇含量采用(μg/g 鲜重)表示。

1.2.5 白藜芦醇茋合酶基因的实时荧光定量PCR检测

根据实验的量效和时效关系分别选取0、0.8、1.6和2.4 mM的FeCl3溶液处理葡萄愈伤组织18 h，用RNAprep Pure 多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取RNA(天根生化科技有限公司，北京)，参考方法[18]；cDNA第一条链合成根据(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，美国Fermentas 公司)推荐方法[19]进行；根据参考文献设计葡萄白藜芦醇合成途径关键酶茋合酶(STS)基因引物[20]，内参18 S rRNA基因[21]，实时荧光定量PCR按照(QuantiFast SYBR Green PCR Kit，QIAGEN)说明书方法进行。表1

1.3 数据统计

所有试验设3个平行组或重复3次，结果以平均值±标准偏差(Mean values ± S)表示，以t检验进行组间统计学差异比较。

表2 引物序列

Table 2 Primer sequences table

引物缩写登录号引物序列分子量(KD)STS1DQ3663015’-CGAAGCAACTAGGCATGTGT-3’5’-CTCCCCAATCCAATCCTTCA-3’13418SAF2070535’-TGGCCTTCGGGATCGGAGTAA-3’5’-ATCCCTGGTCGGCATCGTTTAT-3’201

2 结果与分析

2.1 FeCl3溶液对葡萄愈伤组织白藜芦醇的诱导作用

研究表明，随着FeCl3溶液浓度的增加，其葡萄愈伤组织中白藜芦醇含量明显升高；且1.6 mM FeCl3处理组其含量达到最大，为210.8 μg/g鲜重；2.0 mM FeCl3溶液处理组含量有所下降但仍整体高于空白组。通过1.6 mM FeCl3溶液处理不同时间后测定愈伤组织中白藜芦醇的变化，发现随着FeCl3溶液暗孵育时间的增加，白藜芦醇的诱导量先增加后降低，在18 h时达到最高205.7 μg/g，表现出一定的时效依赖关系。图2～4

与空白组相比**P< 0.01

**P<0.01, vs vehicle control

图2 FeCl3溶液对葡萄愈伤组织白藜芦醇诱导的量效关系(18 h)

Fig. 2 The dose-effect of FeCl3solution on resveratrol content in grape callus by18 hours treatment

与空白组相比**P< 0.01

**P<0.01, vs vehicle control

图3 FeCl3溶液(1.6 mM)对葡萄愈伤组织白藜芦醇诱导的时效关系

Fig. 3 The time-effect of 1.6 mM FeCl3solution on resveratrol content in grape callus

图4 1.6 mM FeCl3溶液处理葡萄愈伤组织18 h后HPLC

Fig. 4 The HPLC analysis of grape callus with 1.6 mM FeCl3solution treatment for 18 h

2.2 FeCl3溶液对葡萄白藜芦醇合成酶基因转录水平的上调

为了明晰FeCl3溶液对葡萄愈伤白藜芦醇诱导与白藜芦醇合成途径的关系，实验对白藜芦醇合成关键酶STS的基因表达进行测定，发现STS的表达量随着FeCl3溶液浓度的升高而升高，具有明显的量效关系，最高STS表达量出现在2.4 mM FeCl3溶液浓度处理组。图5

2.3 DAB染色的结果

DAB可以与过氧化氢和三价铁离子反应，在390 nm处测定吸光值。随着FeCl3溶液浓度的增加，对照组和实验组的吸光值均增大，且△OD390值也存在增加的趋势。表明FeCl3溶液会使愈伤组织产生过氧化氢，而产生过氧化氢的量与FeCl3溶液的浓度呈正相关。图6

与空白组相比*P< 0.05，**P< 0.01

*P<0.05, **P<0.01, vs vehicle control

图5 FeCl3溶液对葡萄愈伤组织白藜芦醇合成酶(STS)基因表达

Fig. 5 The effect of FeCl3solution on stilbene synthase gene (STS) expression in grape callus by 18 hours treatment

与空白组相比*P< 0.05，**P< 0.01

*P<0.05, **P<0.01vs vehicle control

图6 DAB染色后红地球葡萄叶片愈伤组织中的△OD390值

Fig. 6 The values of △OD390in grape callus stained by DAB

2.4 抗氧化剂预处理后葡萄愈伤组织中白藜芦醇的含量变化

基于之前葡萄愈伤组织白藜芦醇含量升高与FeCl3溶液的时效和量效关系，实验研究选用1.6 mM的FeCl3溶液暗孵育18 h。CAT是H2O2的特异性的清除酶，NAC是细胞内谷胱甘肽(GSH)的前体物质，两者都是活性氧的清除剂。可以看出，抗氧化剂CAT和NAC预处理后葡萄愈伤组织中白藜芦醇的含量较1.6 mM FeCl3溶液单独处理组明显降低，表明引起氧化胁迫和茋类物质的积累存在一定的相关性。图7

与空白组相比**P< 0.01，与FeCl3组相比##P< 0.01

**P<0.01compared with the control group,##P< 0.01 compared with the FeCl3group

图7 抗氧化剂预处理后葡萄愈伤组织中白藜芦醇的含量变化

Fig.7 The change of resveratrol content after antioxidants pretreatment in grape callus

3 讨 论

实验材料采用红地球葡萄的继代愈伤组织，愈伤组织细胞本底物质含量低，施加外界诱导因素易于观察本底物质含量变化。愈伤组织细胞为脱分化的细胞，较叶片或其他植物组织更易于进行诱导。此外，愈伤组织细胞生长环境一致，受外界影响小，更易于进行实验比较和结果分析。

铁元素是葡萄所需要的大量元素，且Fe3+有一定的氧化性、无毒等优势。实验研究发现FeCl3溶液能引起红地球葡萄叶片愈伤组织茋类物质显著积累，且白藜芦醇的积累与FeCl3溶液存在量效和时效依赖关系，增加了葡萄茋类物质积累的非生物诱导剂的范围。高浓度(2.0 mM )FeCl3溶液诱导量反而下降，这与Adrian等[1,8]使用氯化铝和黄芳爱等[6]使用H2O2作为葡萄白藜芦醇诱导剂的研究结果类似，其原因可能是随着处理浓度和时间的增加，叶片损伤程度加重会导致诱导效果减弱。茋类物质是通过苯丙氨酸途径合成，而已知葡萄STS基因均具有诱导表达的特性，即在一般条件下其合成途径被关闭，只有受到病原菌或各种诱发因子诱导后合成才被激活，此时茋类化合物在受激部位的含量显著增加[22,23]。研究中FeCl3溶液对葡萄STS转录水平的诱导量效关系明确而又显著，解释了FeCl3溶液促进了茋类物质白藜芦醇的合成部分原因。同时FeCl3溶液具有低毒、易于在植株上操作、作用可靠等优点，FeCl3溶液可以作为葡萄叶片愈伤组织白藜芦醇的有效诱导剂。

在已有报道中，非生物诱导方式中以紫外(UV)对茋类物质的诱导最为显著[1]。Tang 等[15]研究发现UV胁迫既会诱导花生幼苗叶片中白藜芦醇的积累，又会诱导其H2O2和O2-的积累。研究DAB染色结果发现FeCl3溶液也可以提高葡萄愈伤组织中活性氧的水平进而引起其氧化胁迫。而加入活性氧清除剂CAT和NAC预处理后，FeCl3组的愈伤组织中白藜芦醇的含量明显降低。CAT是H2O2的特异性的清除酶，NAC是细胞内还原力谷胱甘肽(GSH)的前体物质，二者均能够有效减少活性氧产生[24]。通过DAB染色与加入活性氧清除剂CAT和NAC预处理的研究结果，正反两个方向验证了FeCl3溶液诱导葡萄叶片愈伤组织中茋类物质白藜芦醇的积累和其引起氧化胁迫存在一定相关性。

4 结 论

白藜芦醇作为植保素对葡萄的抗病防卫有着重要的作用。FeCl3溶液对红地球葡萄叶愈伤组织白藜芦醇积累具有显著升高作用，其积累机制与FeCl3所导致的氧胁迫正相关。FeCl3溶液在葡萄的贮存、保鲜上具有潜在的应用价值。

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Fund project:Supported by NSFC (31160058) and science and technology research projects in key fields of XPCC (2014BA029)

The Relationship between FeCl3-induced Resveratrol Accumulation and Oxidative Stress in Grapevine Callus

LI Yue-rong1, LI Rong-fei1, ZHANG Bo1,2, LI Di-di1, WANG Xiao- qin1

(1.CollegeofPharmacy,ShiheziUniversity.ShiheziXinjiang832002,China;2.KeyLaboratoryofXinjiangEndemicPhytomedicineResources,MinistryofEducation,CollegeofPharmacy,ShiheziUniversity,ShiheziXinjiang832002,China)

【Objective】 To find a resveratrol elicitor on grape, present study takes an preliminary work for developing antistaling agents in grape storage.【Method】The detached grape leaf callus (VitisviniferaL.cv.Red Globe) were treated with different concentrations of FeCl3aqua solution. The content of resveratrol in samples was analyzed by HPLC assay. The biosynthetic regulation of stilbenes was determined as the quantity of stilbene synthase (STS) by realtime PCR methods. ROS levels were detected with DAB stain method.【Result】The results showed that resveratrol accumulated significantly in both dose- and time-dependent manners with FeCl3treatments. Furthermore, the maximum content of resveratrol reached 210.8 μg/g achieved by 1.6 mM plus 18 hours treatment in treated grape callus, whose content is was 8.5-fold higher than untreated samples. It showed that ROS levels in the FeCl3treatments were higher than those untreated. ROS scanvagers CAT and NAC significantly reduced resveratrol content in FeCl3treatments.【Conclusion】Therefore, FeCl3solution has significantly increased resveratrol accumulation in the grape leaf callus via an accumulation mechanism positive related to oxidative stress.

resveratrol; FeCl3solution; grape callus; oxidative stress.

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.01.020

2015-06-30

国家自然科学基金项目(31160058)；新疆兵团重点领域科技攻关项目(2014BA029)

李月荣(1990-)，四川威远人，硕士研究生，研究方向为生物技术制药，(E-mail)yueronger512@163.com

张波(1978-)，陕西宝鸡人，教授，博士，研究方向为肿瘤药理及生物技术制药，(E-mail)Bozhang_lzu@126.com

S663.1;S188

A

1001-4330(2016)01-0149-07