自然杀伤T淋巴细胞对黑色素瘤细胞的免疫调节及杀伤功能实验研究

黄建敏，师煜博，陈忠华

(1.广西医科大学第一附属医院检验科，广西南宁 530021；2.广西医科大学第一附属医院呼吸疾病研究所，

广西南宁 530021；3.华中科技大学同济医学院同济医院器官移植研究所，湖北武汉 430030)



·论著·

自然杀伤T淋巴细胞对黑色素瘤细胞的免疫调节及杀伤功能实验研究

黄建敏1，师煜博2△，陈忠华3

(1.广西医科大学第一附属医院检验科，广西南宁 530021；2.广西医科大学第一附属医院呼吸疾病研究所，

广西南宁 530021；3.华中科技大学同济医学院同济医院器官移植研究所，湖北武汉 430030)

摘要:目的探讨自然杀伤T淋巴细胞(NKT细胞)在细胞免疫调节及杀伤功能中的作用。方法建立混合淋巴细胞培养(MLC)体系，B16F10-luc-G5细胞作为靶细胞，以总淋巴细胞为效应细胞。(1)调节效应实验以NKT细胞或CD4+CD25+T淋巴细胞为调节细胞，分为3组：NKT组、CD4+CD25+T组、靶细胞空白对照组；另设有1640空白对照组(RPMI1640溶液)。(2)杀伤效应实验以NKT或自然杀伤(NK)细胞为效应细胞，分为3组：NKT组、NK组、靶细胞空白对照组。混合培养24、48、72 h后，通过活体成像系统检测该培养系统的靶细胞生物发光，以监测NKT细胞的调节及杀伤效应。结果(1)调节效应实验：NKT组及CD4+CD25+T组测定光子数分别与两空白对照组比较，以及NKT组内培养24 h与72 h时测得光子数比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。(2)杀伤效应实验：NKT组及NK组与靶细胞空白对照组所测光子数比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；且培养24 、72 h时NKT组与NK组光子数比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论NKT细胞具有抑制总淋巴细胞对靶细胞的杀伤效应，且抑制效应具有时间性，其调节作用较CD4+CD25+T淋巴细胞强。NKT细胞具有对靶细胞的杀伤效应，但较NK细胞弱。

关键词:自然杀伤T淋巴细胞；自然杀伤细胞；CD4+CD25+T淋巴细胞；B16F10-luc-G5细胞；活体成像系统

人体体内有少许T淋巴细胞表面能表达自然杀伤细胞(NK细胞)特有的标志，这部分细胞称为自然杀伤T淋巴细胞(NKT细胞)。NKT细胞参与体内免疫调节、维持免疫稳定、防止器官移植排斥，在抗肿瘤免疫中发挥着重要作用。可以通过分析NKT细胞是否具有调节总淋巴细胞的杀伤效应，研究T淋巴细胞在肿瘤免疫中的作用。本实验主要应用活体成像系统(IVIS)，在混合淋巴细胞培养(MLC)中分析带荧光素标记的B16F10-luc-G5黑色素肿瘤细胞，通过平均光子数的变化验证NKT细胞是否具有抑制总淋巴细胞对靶细胞的杀伤效应，以及是否具备与NK细胞相似的杀伤靶细胞的作用。现将结果报道如下。

1材料与方法

1.1实验动物及细胞系小鼠黑色素瘤细胞株B16F10-luc-G5购自美国Xenogen公司；雄性健康封闭群BALB/c小鼠购自华中科技大学同济医学院器官移植研究所动物中心。

1.2方法冻存肿瘤细胞快速融化，加入含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640生长培养基中，获取BALB/c小鼠淋巴细胞后，与淋巴细胞分离液混合，分离并分选NKT细胞、NK细胞、CD4+CD25+T淋巴细胞。以总淋巴细胞为效应细胞，B16F10-luc-G5肿瘤细胞为靶细胞，效应细胞与靶细胞的比例为效靶比，建立MLC并进行分组。NKT组：效靶比为20∶1，每孔加总淋巴细胞5×104个、靶细胞2.5×103个；CD4+CD25+T组：效靶比为10∶1，每孔加总淋巴细胞2.5×104个、靶细胞2.5×103个；靶细胞空白对照组：每孔加靶细胞2.5×103个；每组均3个复孔；1640空白对照组：仅为RPMI1640溶液。MLC建立后继续培养，分别于24、48、72 h检测生物发光，加入细胞孔中显像。

2结果

2.1NKT细胞和CD4+CD25+T淋巴细胞的分离与鉴定利用流式细胞仪分离Babl/c小鼠脾细胞获得NKT细胞和CD4+CD25+T淋巴细胞，经流式细胞仪检测其纯度分别为94.6%、93.3%。见图1～4(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。

2.2NKT细胞的调节效应NKT组及CD4+CD25+T组分别与两空白对照组测定光子数比较，以及NKT组内24 h与72 h时测得光子数比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。通过IVIS法绘制MLC系统中靶细胞(B16F10-luc-G5细胞)生长状态图，见图5(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。表明混合培养24、48、72 h时，NKT细胞和CD4+CD25+T细胞均抑制总淋巴细胞的杀伤功能。

2.3NKT细胞的杀伤效应NKT组各检测时间点光子数均低于CD4+CD25+T组和靶细胞空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；而各时间点CD4+CD25+T组光子数与靶细胞空白对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。以IVIS结果绘制靶细胞生长状态图，见图6(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。

2.4NKT与NK细胞直接杀伤靶细胞的效能比较NKT组和NK组各检测时间点光子数与靶细胞空白对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；且NKT组与NK组24及72 h时光子数比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。以IVIS结果绘制靶细胞生长状态图，见图7(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。

表1　　不同时间点调节效应实验MLC中靶细胞光子数比较

*：P<0.05，与1640空白对照组比较；#：P<0.05，与靶细胞空白对照组比较；△：P<0.05，与同组24 h时测得的光子数比较。

表2　　不同时间点杀伤效应实验MLC中靶细胞光子数比较

*：P<0.05，与NKT组比较。

表3　　不同时间点直接杀伤靶细胞效应实验MLC靶细胞光子数比较

*：P<0.05，与靶细胞空白对照组比较；#：P<0.05，与NK组比较。

3讨论

NKT参与体内免疫调节、维持免疫稳定并防止器官移植排斥，在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。本实验的目的在于研究NKT细胞能否调节总淋巴细胞的杀伤效应，通过比较NKT细胞与经典的CD4+CD25+T调节细胞的体外调节功能，以及NKT细胞与NK细胞对肿瘤细胞的直接杀伤效应，分析NKT细胞的功能。

体外研究表明，在抗原刺激下，NKT细胞可被CD1d提呈的糖脂类抗原激活,α-半乳糖神经鞘胺醇(α-GalCer)为NKT细胞的一种高效、特异的刺激抗原。NKT细胞可迅速分泌大量具有免疫调节作用的细胞因子，类似于辅助性T淋巴细胞2(Th2)型分泌白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-13(IL-13)、干扰素-γ(IFN-γ) 等，从而影响免疫反应类型，实现对免疫应答和自身免疫的调节。Kawano等[1]从人外周血中分离Vα24 NKT细胞，经α-GalCer活化，与恶性黑色素瘤细胞株HMV-1、胰腺癌细胞株PANC-1等多种人类肿瘤细胞系进行作用，结果发现Vα14+NKT细胞具体外杀伤肿瘤细胞的效应，活化的Vα24 NKT细胞对多数肿瘤细胞均有明显的杀伤作用。在未预先致敏的情况下，白细胞介素-12(IL-12)与α-GalCer共同活化的NKT细胞对多种肿瘤细胞系和自体肿瘤组织均具有明显的细胞毒活性。由IL-12治疗诱导出的NK1.1+V142Jα281+NKT细胞可以介导肿瘤排斥，过往输注经IL-12活化的Vα14 NKT细胞可有效阻止小鼠B16黑色素瘤肝脏转移灶的形成[2]。研究证明，NKT细胞被α-GalCer激活后分泌的IFN-γ在肿瘤排斥反应中起着关键作用[3]。Vα24+NKT细胞的细胞毒性是通过穿孔素介导的，并且T淋巴细胞受体(TCR)Vα24 、CD1d和α2脑苷脂也起一定作用[4]。NKT细胞并不直接杀伤肿瘤细胞，而是通过IFN-γ介导下游效应细胞，如NK细胞和CD8+T淋巴细胞的积聚并提高其对肿瘤的敏感性而发挥抗肿瘤效应[5]。α-GalCer和IL-12激活的NKT细胞可增强NK和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的抗肿瘤活性，也可促进抗原呈递细胞(APC)活化与上调CD40L表达，从而进一步促进IL-12的产生，使肿瘤免疫得到加强[6]。α-GalCer可抑制许多肿瘤的肝转移，且为激活的NKT细胞的肿瘤杀伤效应。NKT细胞既可通过识别靶细胞上的CD1d-ligand复合物直接介导抗肿瘤反应[6]，亦可通过分泌白细胞介素-2(IL-2)和IFN γ激活NK细胞，间接介导抗肿瘤反应[7]。

本文实验结果证明，NKT在体外进行混合培养时，可发挥对B16F10-luc-G5细胞的杀伤效应，该杀伤效应具有时间性，随时间的延长达到更大的靶细胞杀伤作用。通过与NK细胞的平行比较发现，NKT与其有相似的抗肿瘤功能。NK细胞是细胞复杂的免疫调节网络中的重要组分，而NKT细胞是免疫细胞中一个具特定标志的T淋巴细胞亚群，不同于NK细胞，两者均有抗肿瘤细胞效应。虽然NKT细胞在抗肿瘤能力上弱于NK细胞，两者在机体内的功能和作用机制是否与体外实验相似，还需进一步研究。

另外，NKT细胞可下调机体的免疫监视能力，导致肿瘤的发生。Moodycliffe等[8]发现，从紫外线照射的小鼠分离得到的NKT细胞，作为抑制性T淋巴细胞在调节紫外线诱发的皮肤癌细胞生长中具有重要作用，可抑制体内获得性免疫的产生。紫外线辐射的致癌作用及引起的免疫抑制是通过NKT细胞来实现的[8]。本次实验结果显示，在MLC系统中，NKT可以抑制总淋巴细胞对B16F10-luc-G5细胞的杀伤效应，在培养24～48 h内可达到一定的抑制效应，但培养时间超过48 h后，该抑制效应明显减弱，通过与经典的调节T细胞(CD4+CD25+T细胞)进行平行比较，NKT亦具有相似的抑制总淋巴细胞杀伤效应的作用。本次实验可初步显示NKT具有双向效应，既具备抗瘤作用又有免疫抑制作用。因此，笔者认为需要对NKT进行更深入的研究，特别是其释放的细胞因子的浓度及相关蛋白质组的变化，以期将针对NKT细胞的相关检测数据应用于临床医学检验实验室，以利于临床疾病的有效诊治。

综上所述，NKT细胞在肿瘤免疫调节及肿瘤杀伤中起一定作用，国外临床上已有针对NKT进行的肿瘤免疫靶向治疗，已达到良好的效果，说明NKT细胞在抑制某些肿瘤的发生、发展机制中起着重要作用。

参考文献

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[2]Schmieg J，Yang G，Franck RW，et al．Superior protection against malaria and melanoma metastases by a C-glycoside analogue of the natural killer T cell ligand alpha-galactosylceramide[J]．J Exp Med，2003，198(11):1631-1641.

[3]Gehrmann U，Hiltbrunner S，Näslund TI，et al．Potentiating antitumor immunity with αGC-loaded exosomes[J]．Oncoimmunology，2013，2(10)：e26261.

[4]Nakamura T，Yamazaki D，Yamauchi J，et al．The nanoparticulation by octaarginine-modified liposome improves α-galactosylceramide-mediated antitumor therapy via systemic administration[J]．J Control Release，2013，171(2):216-224.

[5]Smyth MJ，Crowe NY，Pellicci DG，et al．Sequential production of interferongamma by NK1.1(+)T cells and natural killer cells is essential for the antimetastatic effect of alpha-galactosyl ceramide[J]．Blood，2002，99(4)：1259-1266.

[6]Fujii S，Shimizu K，Smith C，et al．Activation of natural killer T cells by alpHa-galactosylceramide rapidly induces the full maturation of dendritic cells in vivo and thereby acts as an adjuvant for combined CD4 and CD8 T cell immunity to a co-administered protein[J]．J Exp Med，2003，198(2)：267-279.

[7]Fujii S，Shimizu K，Okamoto Y，et al．NKT cells as an ideal anti-tumor immunotnerapeutic[J]．Front Immunol，2013，4(4)：409．

[8]Moodycliffe AM，Nghiem D，Clydesdale G，et al．Immune suppression and skin cancer development:regulation by NKT cells[J]．Nat Immunol，2000，1(6)：521-525.

Study on the immunoregulatory and lethal effects of natural killer T cells on melanoma cells in vitro

HuangJianmin1，ShiYubo2△，ChenZhonghua3

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning,Guangxi530021,China；2.InstituteofRespiratoryDisease,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning,Guangxi530021,China；3.InstituteofOrganTransplantation,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan,Hubei430030,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the immunoregulatory and lethal effects of natural killer T lymphocytes(NKTs) in vitro.MethodsThe mixed lymphocyte cultured(MLC) system was established, in which the B16F10-luc-G5 cells were set as target cells, the total lymphocyte cells were set as effector cells.(1)In the experiment on immunoregulatory effects, NKT lymphocytes or CD4+CD25+ T lymphocytes were set as regulating cells, there was three groups, including the NKT group, CD4+CD25+ T group and pure target cell control group.Otherewise, the 1640 blank control group was set by only adding RPMI1640 solution.(2)In the experiment on antitumor effects, the NKT or natural killer(NK) lymphocytes were set as killer cells, there was three groups, including the NKT group, NK group and pure target cell control group.Mixed culturing 24, 48 and 72 hours, the bioluminescence of target cells in MCL system was detected by using the in vivo imaging system.Results(1)In the experiment on immunoregulatory effects,there were statistically significant differences in measured average photon numbers between NKT group, CD4+CD25+ T group and the two control groups(P<0.05).The statistically significant differences were also found in the NKT group between 24 hours and 72 hours (P<0.05).(2)In the experiment on antitumor effects,there were statistically significant differences in measured average photon numbers, when the NKT group and NK group were compared to the pure target cell control group(P<0.05).After culturing 24 and 72 hours,statistically significant differences were found between NKT group and NK group(P<0.05).ConclusionThe NKT cells could inhibit the lethal effects of lymphocyte cells on target cells, and the inhibitory effects are changed by the length of culturing.Compared with the CD4+CD25+T lymphocytes, NKT lymphocytes have strongger regulatory effects.Additionally, the NKT cells have lethal effects on target cells, which might be weaker than that of NK cells.

Key words:natural killer T cells；natural killer cells；CD4+CD25+ T lymphocytes；B16F10-luc-G5 cells；in vivo imaging system

(收稿日期：2015-12-26)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.014

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)05-0613-03

作者简介：黄建敏，男，讲师，主要从事临床免疫与微生物学检验研究。△通讯作者，E-mail：phoenixdan@126.com。