苦参抑菌活性成分的化学结构与作用机理

韩宝艳++纪明山++刘妍++沈俭龙

摘要：采用硅胶柱层析和HPLC分离技术从苦参中获得1个抗病原真菌化合物，采用质谱和核磁共振波谱等技术鉴定了其化学结构，并评价了其对番茄灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌、水稻稻瘟病菌的菌丝生长、产孢的抑制作用。经过质谱、核磁共振氢谱（1HNMRH）和碳谱（13CNMR）鉴定，发现其为已知结构苦参新醇X（kushenolX）。该物质对番茄灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌、水稻稻瘟病菌的菌丝均有抑制作用，当处理浓度为200 mg/L时，对3种病原真菌的抑制率均在60%以上，其中对水稻稻瘟病菌的抑制率达到83.13%；该物质对3种病原菌孢子产生也有较强抑制作用，200 mg/L下3种病原真菌的产孢抑制率均在80%以上。

关键词：苦参；抑菌活性；作用机理；黄酮类化合物；病原真菌

中图分类号： R284.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）02-0170-03

收稿日期：2015-03-21

基金项目：公益性行业（农业）科研专项（编号：201303025）。

作者简介：韩宝艳（1987—），女，硕士研究生，研究方向为生物农药。E-mail：dongfangyuling@163.com。

通信作者：纪明山，博士，教授，主要从事农药毒理学研究。E-mail：jimingshan@163.com。苦参（Sophora flavescens）别称山槐子，为豆科槐属植物。苦参提取液的化学成分主要为生物碱、黄酮2大类[1]。近年来国内外研究苦参的重点在于生物碱，对黄酮类成分的研究较少。随着分离技术不断提高，进一步发现了苦参中黄酮类的多种药理活性，引起了广泛重视和兴趣[2]。贾利元等在研究苦参提取物对茄子黄萎病菌的化感效应时发现，苦参生物碱处理的抑菌率均低于同浓度黄酮类化合物处理的抑菌率[3]。李巍等研究苦参黄酮抗滴虫和抗菌等作用机制和构效关系时，分离出5 - 甲氧基-7，2′，4′ - 三羟基- 8 - 异戊烯基二氢黄酮和3β，7，4′ - 三羟基-5 - 甲氧基-8 - 异戊烯基二氢黄酮2个新化合物[4]。截至2014年，已从苦参中分离出108个黄酮类化合物[5]。黄酮类化合物是多酚类植物的次级代谢产物，具有许多潜在的药用价值和生物活性，其中抑菌活性是研究热点之一[6]。郑永权等以生物活性追踪试验为指导，从苦参提取物中分离出2个主要杀虫抑菌活性化合物苦参酮和槐属二氢黄酮G[7]。Kuroyanagi从苦参中分离出23种化合物，12种为新分离出的化合物，其中8种为异戊烯黄烷酮类，这些化合物都显示出明显的抗菌作用[8]。国内外对苦参黄酮类化合物抑菌作用的研究集中在抗菌能力测定，有关作用机理的研究甚少。本研究采用硅胶柱色谱法、HPLC、质谱、核磁共振对苦参黄酮类中抑菌活性成分进行分离鉴定，通过菌丝生长速率法检测其对番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium ）、水稻稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的抑菌效果，并对该活性成分的作用机理进行初步研究，以期为后续研究奠定基础。

1材料与方法

1.1供试植物样品

苦参，自然晒干，用粉碎机粉碎备用。

1.2供试菌

番茄灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌、水稻稻瘟病菌由沈阳农业大学农药学实验室提供。

1.3试剂

95%乙醇溶液、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、乙醚、石油醚等均为分析纯。

1.4活性成分的提取与分离

将苦参粉碎物分别与95%乙醇溶液、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醚等按1 g ∶10 mL比例混合，静置1 h，超声频率为90 kHz，经超声波清洗器振荡提取1 h。浸提后过滤留滤液，弃去废渣，并用旋转蒸发仪浓缩至浸膏[9-10]，分别进行生物活性测定。

选择苦参抑菌活性较强的乙酸乙酯提取物进行硅胶柱层析，以体积比1 ∶10的甲醇-氯仿混合溶剂和体积比1 ∶15的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂为洗脱剂依次进行等梯度洗脱，等体积（50 mL）收集馏分，经薄层层析检测，将相同斑点合并，最终获得2个馏分[11]。

经过抑菌活性测定，选择抑菌活性较强的馏分，采用反相制备HPLC（C18柱，5 μm，10 mm×250 mm；甲醇-水（体积比6 ∶4）等梯度洗脱，流速3 mL/min，柱温30 ℃，波长297 nm，采集时间1 h，进一步纯化，获得到化合物A。

3结论与讨论

在制备供试品时，本研究考察了不同溶剂（95%乙醇溶液、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醚） 超声提取方法，结果发现乙酸乙酯超声提取法获得的物质对番茄灰霉病菌的抑制作用最强。对粗提物进一步分离纯化，获得了苦参新醇X，查阅文献发现，Kuroyanagi等在1999年将苦参新醇X作为一种新化合物从苦参中分离出来[8]。

黄酮类化合物是一类植物次生代谢产物，广泛存在于多种植物中，不仅数量、种类繁多，而且结构类型复杂多样[16]。黄酮类化合物是苦参主要成分之一。本研究分离鉴定出的苦参新醇X即二氢黄酮醇（黄烷酮醇），已有研究表明，该物质对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等细菌有较强的抑制作用。本研究表明，该物质对番茄灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌、水稻稻瘟病菌均有抑制作用。在200 mg/L处理下，其对水稻稻瘟病菌的抑制作用最高，抑制率达83.13%。本研究对其作用方式进行初步探讨，发现该物质虽然可以抑制这3种病原真菌的菌丝生长，但并未将菌丝杀死，一旦抑制作用解除，菌丝就恢复生长能力。苦参新醇X不仅对这3种病原真菌的菌丝起到抑制作用，对其孢子产生也具有强烈抑制作用，200 mg/L下产孢抑制率均在80%以上。本研究仅针对苦参黄酮类化合物进行了初步抑菌试验及抑菌机理研究。苦参黄酮类化合物是否能够抑制病原真菌内部酶的活性，以及对病原真菌的能量代谢和物质代谢有何种影响，还须进一步研究。

抗菌试验使用的大多是粗提物，成分复杂，对黄酮单体的抑菌活性研究较少[6]。而且单体结构复杂，作用机理不明确，抗菌研究不深入。这些都是应用过程中必须解决的问题。

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