发光细菌及其在环境、食品和饲料检测中的应用

廖德丰

(谱尼测试集团上海有限公司 200030)

1 发光菌发光机理、发光特性、影响因素和发光基因

1.1 发光机理 发光菌能够以长链脂肪醛(LE)、分子氧和还原型黄素单核苷酸(FMNH2)为底物，在荧光素酶的催化作用下，产生波长约为450～490 nm蓝绿光。反应过程如下：FMNH2+LE→FMNH2·LE+O2→LE·FMNH2·O2+RCHO→LE·FMNH2·O2·RCHO→LE·FMN+H2O+RCOOH+光，其中三步反应产生的三种中间产物的寿命极短，很难分离出来。发光细菌发出的光是一种化学发光,是化学能以光辐射的方式的释放。发光细菌细胞内含有荧光素和荧光素酶,荧光素受到荧光素酶的催化作用而吸收能量,变成氧化型激发态荧光素，随即退激发射光子而发光。荧光素酶是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶，细菌荧光素酶是含α、β两个多肽亚基的单加氧酶，只有两个亚基共存时才有活性。从不同海洋细菌中提取的荧光素酶的分子量差别不大。

1.2 发光特性 不同种类的发光菌有不同的荧光素酶,发光特性也不同。以最大发射波长来说,弧菌属为482～485 nm,发光杆菌属则在474～480 nm。其中费氏弧菌最大发射波长为482 nm，东方弧菌最大发射波长为(484±1) nm,半峰全宽为(92±1) nm，青海弧菌最大发射波长为485 nm，明亮发光杆菌最大发射波长为475 nm左右。朱文杰等从东方弧菌的细胞裂解液中分离到一种组分,仅需长链脂肪醛就可以启动发光,其最大发射峰在480～490 nm。提取物的吸收光谱显示在414 nm处有一最大吸收峰,在380 nm和485 nm处各有一个弱吸收峰;提取物与醛反应后，吸收光谱除380 nm峰消失外,其余不变。汪杰等[1]检测了明亮发光杆菌、鰏鱼发光杆菌、哈维氏弧菌和青海弧菌生物发光的一阶和二阶微分光谱。结果表明，不同种的发光细菌的微分光谱有显著差异，同一种菌的不同菌株无显著差异，提示生物发光光谱可作为发光细菌菌种分类的特征。

1.3 影响因素 发光菌的发光强度与细胞的代谢活性直接相关，环境因素会影响发光菌的生长和发光。杜宗军等从青岛近海海洋沉积物中分离出一株海洋发光菌——弧菌属的哈维氏发光弧菌，该菌在pH7. 5、温度30℃、氯化钠浓度3.0%时,发光强度最高;正常发光的温度在20℃～40℃、pH6.0～8.0; 液体培养4 h后开始发光, 6 h后发光达到峰值,持续发光时间可达19 h。水体的pH、温度、盐度和营养成分等环境条件的变化将引起荧光素酶的改变,从而改变细菌的发光特性。方宏达等分离到一株海洋发光弧菌，它在35℃、pH7.0、氯化钠浓度2.0%时生长最好，在20℃、pH5～6、氯化钠浓度3.0%、细菌密度OD600达0.08时发光强度最高。当发光弧菌的密度OD600达到0.08时，发光强度有一个突发式的增强过程，这个现象表明这些菌的发光可能受到细菌密度感应系统的调控。密度感应是细菌感受种群密度的变化而控制特定基因表达的一种机制。自由生活的哈维氏弧菌可以利用密度感应系统来控制发光。

青海弧菌的生长受甘油影响最大，发光受氮源影响最大，其生长和发光不同步，发光强度到对数中期才迅速增加，并在对数后期达到顶峰，然后很快下降。由此看来，青海弧菌荧光酶的合成属于诱导型。甘油和少量氯化钠有利于青海弧菌的生长和发光。在许多方面环境因子对青海弧菌的生长和发光的影响与海洋发光菌中诱导型发光型相似，可能的原因是它们的受影响机制相似，但在盐度、温度和pH等方面，青海弧菌与海洋发光菌不同，青海弧菌适宜的温度和pH范围比海洋发光菌宽，对氯化钠的要求很低，可能是因为它们长期适应于不同的环境。

发光细菌的发光强度在一定实验条件下是恒定的，当发光菌接触外来物质时，发光强度改变。有毒物质会使发光菌细胞的代谢活性下降，发光强度下降，因此发光菌发光强度的变化能够准确、快速地反映外来物质的毒性。

1.4 发光基因 目前对发光菌的研究已经达到基因水平，细菌发光是其发光基因及其操纵子表达调控的结果。发光细菌发光离不开荧光素酶，研究发现,编码荧光素酶的基因是luxA和luxB。发光基因包括结构基因luxC、luxD、luxA、luxB、luxE(为在操纵子上的排列顺序)和调节基因luxI和luxR等，luxC和luxD位于luxA和luxB基因的上游一侧，luxE基因位于luxA和luxB基因的下游一侧。luxC、luxD、luxA、luxB和luxE这5个结构基因存在于已知的所有发光细菌中。在lux操纵子中，luxA和luxB是紧密相连的。例如，哈维氏弧菌的luxA基因中含有1065个碱基对(bp)，编码的荧光酶α亚基是355个氨基酸组成的多肽，分子量为40 kD；luxB基因中含有972 bp，编码的荧光酶β亚基是324个氨基酸组成的多肽，分子量为36 kD，由α、β两亚基组成的荧光酶的分子量为76 kD。luxC和luxD分别编码脂肪酸还原酶和多肽转移酶，luxE编码合成酶。luxC含有1431 bp，编码含有477个氨基酸的蛋白质，分子量为55 kD；luxD编码分子量为33 kD的蛋白质；luxE编码分子量为42 kD的蛋白质。发光细菌发光基因的种类和数量因发光细菌的种类而异。例如，luxF仅发现于明亮发光杆菌。已经发现哈维氏弧菌有3个平行密度感应系统来控制荧光素酶的结构操纵子的密度依赖性表达，每个系统都由传感器和相应的自诱导分子组成。

王妍稳等[2]将luxA和luxB克隆到表达载体PHSG396中,转化大肠杆菌Top10,实现重组质粒在大肠杆菌中的表达。罗爱红等[3]将青海弧菌Q67荧光素酶基因luxA和luxB和结构基因luxC、luxD、luxA、luxB、luxE分别在大肠杆菌中表达，在相同培养条件下,luxA和luxB重组菌比luxA、luxB、luxC、luxD、luxE重组菌获得更大的相对发光强度,说明luxA和luxB重组菌表达效果更好。重金属Cd2+、Hg2+和Cr6+对重组菌的毒性影响检测表明,luxA和luxB重组菌得到了更低的半有效浓度(EC50)。魏永涛通过三亲本杂交的方法将标记基因luxA和luxB接合转移进荧光假单胞CP1108菌株，所得的标记菌株CP1108L具有发光活性，转移频率为(4.65±0.01)×105。将标记菌株连续进行20 次传代，各代菌株均可检测到发光现象。

luxI编码发光细菌自诱导物因子合成酶，luxR编码发光系统的调节蛋白。luxI和luxR基因的表达产物都是lux系统完整表达并产生发光的调节物质，任何一个基因的有效突变都会改变lux系统的表达水平，甚至使发光细菌变为暗变种。

2 发光细菌在环境、食品和饲料检测中的应用

2.1 环境检测 利用发光细菌的发光强度作为指标来监测环境中的有毒物质，在国内外越来越受到重视，发光细菌法已经广泛用于环境中的重金属、抗生素、农药等检测，可分析空气、土壤和水等样品。汽车尾气、香烟烟雾和氨气等对细菌发光有不同程度的抑制作用，时间和剂量效应明显。吴淑杭等[4]以明亮发光杆菌T3变种作为测试菌，发现单一重金属Hg2+、Cd2+与 Cr6+对明亮发光杆菌的毒性有显著的正效应,毒性从大至小依次为Hg2+、Cd2+和Cr6+,对明亮发光杆菌的EC50分别为0.044 mg/L、6.05 mg/L和30.65 mg/L，总体上, Hg2+与Cd2+以及Cd2+与Cr6+之间为加和作用,而Hg2+与Cr6+之间以拮抗作用为主。研究发现，明亮发光杆菌T3的相对发光率与硝酸盐、氟化物和敌百虫的浓度呈负相关,其相关系数为-0.90～-0.99。硝酸盐、氟化物和敌百虫作用15 min时使发光细菌产生50%光损失时的浓度(EC5015 min值)分别为2210.00 mg/L、245.2 mg/L和8880.28 mg/L。

抗生素和农药广泛用于农业生产中，污染问题引起广泛的关注。朱祥伟等[5]以毒物对青海弧菌Q67发光抑制为毒性指标，测定了吡虫啉(IMI)、抗蚜威(PIR)、啶虫脒(ACE)及敌百虫(DIP) 4种杀虫剂和氯霉素(CHL)、盐酸四环素(TET)、硫酸链霉素(STR)及硫酸巴龙霉素(PAR) 4种抗生素的短期(15 min)毒性和长期(12 h)毒性。采用短期毒性与长期毒性EC50之比为指标，表征同一物质的毒性差异。结果表明：3种杀虫剂(IMI、ACE和PIR)的短期毒性与长期毒性差异不大；杀虫剂DIP和抗生素CHL及TET的短期毒性与长期毒性差异明显；抗生素STR和PAR只有较强的长期毒性。杨洁等[6]采用青海弧菌Q67 作为测试菌剂,作用时间为15 min。结果表明，5种可溶农药对青海弧菌Q67的毒性从高到低依次为敌敌畏、敌百虫、杀虫单、乐果、乙酰甲胺磷；6种难溶于水农药的毒性从高到低依次为甲氨基阿维菌素、甲胺磷、莎稗磷、高效氯氰菊酯、恶霜灵、氰戊菊酯。中国科学院南京土壤研究所研制出GXY-2型生物毒性测定仪，已经有学者将此仪器和明亮发光杆菌用于评价工业废水和重金属污染土壤的毒性。

在水质分析中,应用浮游生物、藻类和鱼类等水生生物进行毒性检测所需时间长、费用高,而发光菌毒性检测法具有灵敏度高、相关性好、反应速度快、成本低廉、自动化程度高等优点。谢海平等[7]分别利用从发光鱼肉中分离得到的一株鳆发光杆菌N1株和美国Microtox急性毒性检测系统,对珠江陆源入海排污口污水进行了急性毒性对比测试。结果表明,利用鳆发光杆菌N1株的急性毒性测试结果和美国Microtox毒性检测系统的急性毒性测试结果有较好的相关性;依据毒性大小进行排序,珠江陆源入海排污口9个监测站位污水的急性毒性测试数据中，有6个监测站位的排序结果在两种测试间相一致。

2.2 食品检测 食品安全已成为社会普遍关注的问题。在检测不明毒性物质的情况下,发光菌法检测比化学分析或仪器法检测,在检测速度、操作的便捷程度和综合性评价上更具优势。

食品中过量食品添加剂会危害人体健康，发光菌法已经用于检测食品添加剂。郭柔杉等[8]将发光菌法应用于果汁中亚硝酸钠综合毒性的检验，发现其发光强度抑制率与亚硝酸钠溶液质量浓度呈正相关,相关系数为0.9533～0.9573,最佳检测平衡时间为15 min,误差限范围为0.6150～2.3466;发光强度抑制率与果汁中亚硝酸钠质量浓度同样呈正相关,相关系数为0.9555～0.9970,最佳检测平衡时间为15 min,误差限范围为0.0852～2.4483。郭柔杉等[9]利用发光费氏弧菌评价常用色素毒性，发现色素溶液质量浓度与发光抑制率呈正相关,相关系数在0.8760～0.9873之间,EC50范围在0.72～2.86 mg/L之间; 果汁中色素质量浓度与发光抑制率呈正相关,相关系数在0.9136～0.9951之间,EC50值在1.02～2.96 mg/L之间。

食品中抗生素、兽药和农药残留是食品安全关注的重点问题。发光菌法测定食品中抗生素、兽药和农药残留具有快速、简单和价廉等特点。朱金国等[10]利用明亮发光杆菌建立了发光细菌检测四环素族抗生素体系。结果表明，当金霉素、土霉素和四环素浓度在0.00625～1 μg/mL范围内，发光菌发光强度的抑制与这些抗生素的浓度均呈良好的线性关系；该体系对四环素族抗生素的检测灵敏度可达 0.00625μg/mL,比传统的杯碟法高5倍，具有快速、简便的特点。王亚群等[11]从青岛近海分离筛选出1株对氯霉素敏感的鳆发光杆菌，发现氯霉素浓度与细菌发光强度抑制率呈良好的线性关系。该方法的线性范围为0.1～1.0 ng/mL,相关系数R2为0.989,检测灵敏度可以达到0.1 ng/mL。石颖等[15]发现恩诺沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、沙拉沙星、诺氟沙星浓度分别为20～2000 mg/L、100～10000 mg/L、20～200 mg/L、10～1000 mg/L和10～1000 mg/L时,青海弧菌的相对发光率随这些兽药质量浓度的降低而增加;暴露时间为15 min时,8种兽药对青海弧菌的急性毒性大小依次为呋喃唑酮>左氧氟沙星>诺氟沙星>磺胺六甲氧嘧啶钠>沙拉沙星>恩诺沙星>环丙沙星>磺胺间甲氧嘧啶纳，毒性最强的呋喃唑酮的EC50值不足毒性最小的磺胺间甲氧嘧啶纳的EC50值1/1000，这与农业部235号公告规定的禁止呋喃唑酮用于所有动物性食品中相吻合。吴淑杭初步建立了青海弧菌、明亮发光杆菌T3变种发光细菌法农产品食用安全性快速评价体系，包括发光细菌法牛奶、鲜猪肉和牛肉食用安全性快速评价方法。另据报道，GXY-2生物毒性测定仪和明亮发光杆菌已经用于快速检测蔬菜有机磷农药残留。

发光菌法可以快速检测饮用水综合毒性。王晓媛等[13]报道采用以青海弧菌Q67为检测试剂的水质毒性检测系统对汶川地震灾区居民126个饮用水源进行急性毒性的测定，同时与当地检测部门的理化检测指标进行对比，结果表明，现场急性综合毒性快速检测在这次突发事件中起到了样品的毒性快速初筛的作用，在很大程度上及时保证了当地居民的饮水安全，并大大减轻当地疾控人员工作负担。

2.3 饲料检测 发光菌法不但可以用于食品检测，而且可以用于饲料检测。陈俏梅等[14]发现发光菌对苯酚、灭害灵和Pb2+、Zn2+、Cr+金属离子敏感。在所测定的范围内 ,其发光强度随有毒物质浓度增加而减弱，相关系数在0.92以上；以Hg2 +为毒性对照物；对10种饲料原料和3种人用食品进行测定，其中脱水蔬菜相对抑光率最大，为 39.74%，相当于1.85×10-5% Hg2 +的表征毒性 ,提示该样品可能受到农药和化肥等较严重的污染。研究结果表明盐酸金霉素、吉他霉素、盐霉素、黄霉素对明亮发光杆菌的急性毒性EC50分别为9.21mg/L、146.13mg/L、4.24 mg/L和134.68 mg/L；发光细菌的相对发光强度随着这些抗生素浓度的增加而降低,并分别在2～16 mg/L、25～200 mg/L、1～8 mg/L和25～200 mg/L范围内呈良好线性关系。