骨髓间充质干细胞与纳米羟基磷灰石复合骨修复材料的研究进展*

王会丹，叶利远，井申荣，孟增东

（1.昆明理工大学医学院，昆明650500；2.昆明理工大学附属昆华医院骨科，昆明650032；3.云南省第一人民医院骨科，昆明650032）

1 引 言

骨髓间充质干细胞（BMSCs）是骨髓中一类具有多分化潜能、自我复制和高度增殖的干细胞，诱导后分化为成骨细胞、骨细胞、软骨细胞等多种组织细胞[1]，可作为骨组织工程的理想种子细胞。与一般羟基磷灰石（HA）相比，纳米羟基磷灰石（nHA）具有更好的生物活性和生物相容性，能够更好的与BMSCs复合并促进BMSCs的增殖和分化。然而，目前针对BMSCs与nHA的很多研究只是在体外和动物体内进行，并没有临床上的实际应用。本研究通过对体外和动物体内研究进行综述，找出二者复合的影响因素，为BMSCs与nHA复合骨修复材料临床应用的可行性提供依据。

2 骨髓间充质干细胞（BMSCs）

BMSCs广泛分布于骨髓组织、肌肉组织、骨骼组织等多种组织以及脐带血内，具有自我复制和多向分化的潜能。备受很多研究者关注，并在临床研究中得到广泛应用，尤其是骨组织工程。

根据各个阶段细胞表面抗原不同，BMSCs演变为成骨细胞过程可分为5个阶段：骨祖细胞、前成骨细胞、过度型成骨细胞、分泌型成骨细胞、骨细胞型成骨细胞、骨细胞，这五个阶段为研究BMSCs的成骨分化奠定了理论基础。因胶原蛋白I型（collagen I）本身在未分化的BMSCs中少量表达，待 BMSCs分化后collagen I的表达量升高，而骨钙蛋白（osteocalcin）、骨桥蛋白（osteopontin）和碱性磷酸酶（ALP）以及钙结节只在分化BMSCs中表达、形成。所以，collagen I、osteocalcin、osteopontin表达水平和 ALP的活性可作为检测BMSCs分化、矿化的重要检测指标[2-4]。

3 纳米羟基磷灰石（nHA）

骨组织工程的发展为骨缺损修复带来希望，且大量研究已证实，骨组织工程方法构建的组织工程骨应用于骨缺损修复的可行性[5]，其主要成分是纳米羟基磷灰石。

羟基磷灰石 （HA，Ca10（PO4）6（OH）2）是天然骨的主要成分，具有很好的生物相容性、生物活性和骨传导性[6-7]，是一种很有希望的生物材料。但因纯HA支架材料生物力学性能欠佳，脆性大，且粉末能从骨植入部位发生转移，导致异位骨的形成，所以限制了它在骨组织工程中的应用[8-9]。

天然骨组织中的HA是以十几纳米的晶体状态存在，排列有序，为骨组织提供良好的力学性能[10]。与普通HA相比，nHA复合材料成分与天然骨组织成分更相近，且一些力学性能也得到改善，例如弹性、模量、强度、刚度等[11]。与微米级 HA相比，纳米级HA表面聚集更多原子，增强了nHA的活性，便于与骨组织结合[12]。同时在纳米复合材料中，由于有机物和无机物的聚合，表现出二者所没有的特性[13]，因此，很多能与nHA聚合并促进其降解的无毒有机聚合物被研发出来，例如脱乙酰壳聚糖（CS，（C6H11O4N）n）[14]等。总之，nHA除具有生物可降解性和无毒性之外，还表现出其他相关良好的特性，包括较好的生物相容性、更好的抗菌活性和最小的异物反应性[15-16]。

4 骨髓间充质干细胞与纳米羟基磷灰石的复合

4.1 BMSCs与nHA体外复合和动物体内研究的主要步骤

利用密度梯度离心法，体外获取BMSCs进行原代和传代培养。取其第三或四代细胞与不同浓度nHA颗粒材料在恒温箱中共培养，培养一段时间后，添加诱导液[17]，诱导后将BMSCs与nHA复合效果最好的支架材料植入骨缺损动物体内，观察它与天然骨的愈合和体内降解情况[18]。植入不同时间后，分别将动物处死，取出植入部位的组织，经免疫组织分析，确定支架体内降解情况和植入体内的可行性。

4.2 BMSCs与nHA体外复合和动物体内研究的检测技术和指标

针对BMSCs与nHA复合在体外和动物水平上的检测可概括为以下几方面：首先，在复合后不同时间点，使用倒置显微镜和扫描电子显微镜（SEM）观察诱导一段时间后的培养样品，检测BMSCs与nHA的复合情况，观察BMSCs在nHA上的形态学变化。其次，对BMSCs细胞基质中的肌动蛋白染色并用带有荧光的探针标记，确定BMSCs在nHA颗粒上的粘附性和nHA颗粒对细胞骨架组装的影响。然后，用MTT法或流式细胞仪检测细胞数量，确定细胞生长和增殖情况。最后，可用马松法和钙钴法[19]分别对collagen I和碱性磷酸酶（ALP）染色，检测其表达水平和表达活性，确定细胞是否已分化和nHA颗粒是否对BMSCs的分化有促进作用。

活性氧自由基（ROS）对细胞产生毒副作用，若不被抗氧化剂保护，细胞膜功能将发生紊乱、蛋白质降解、DNA损伤，最终导致细胞死亡。故细胞内ROS的水平能够反映细胞坏死状态，可通过荧光探针测定BMSCs内产生的ROS水平，研究nHA对细胞坏死的影响。Caspase是细胞凋亡过程中一种重要的蛋白酶，可通过检测BMSCs中Caspase-3／7的活性和进行膜联蛋白碘化丙啶染色（PI），用细胞流式仪确定nHA对BMSCs凋亡的影响。此外，针对细胞的矿化情况，可用银染法（Von Kossa）或茜素红染色法[17]对沉积在细胞外基质的钙结节进行染色检测。至于从动物体内取出的植入部位组织，切片后分别用苏木精-伊红（HE）和马松染料对骨形成区域、nHA支架区域和胶原区域进行染色，观察其各自区域的面积百分比，确定支架体内降解情况和植入体内的可行性。

4.3 BMSCs与nHA体外复合和动物体内研究的影响因素

4.3.1 nHA的属性对BMSCs生长和增殖的影响一般nHA的孔径大小为100～400μm时更有利于细胞进入生长，孔隙率大于80%时最有利于细胞附着生长[20]。除孔径和孔隙率的影响之外，nHA表面粗糙程度也可因影响BMSCs基因的表达而影响细胞增殖的速率[21]。当nHA与BMSCs在血清中共培养时，nHA的血清蛋白吸附能力优于微米羟基磷灰石[22]，且吸附的血清蛋白能促进细胞增殖。同样相比于微米羟基磷灰石的粗糙表面，细胞更容易在nHA的光滑表面贴壁和增殖[23-24]，主要是因其较微米羟基磷灰石具有更好的亲水性和更低的负电荷。总之，nHA的属性对BMSCs的影响因素有nHA孔径、孔隙率、表面粗糙程度、蛋白吸附能力以及羟基磷灰石颗粒是否为纳米级。

4.3.2 nHA浓度对BMSCs形态、骨架组装、生存力、坏死和凋亡的影响 经BMSCs检测指标分析，在高浓度nHA颗粒的悬浮液中共培养时，细胞发生聚集、边缘不规则化、肌动蛋白组装受到抑制，并且出现一些不能扩张的液泡。然而，在低浓度的nHA悬浮液中，细胞的形态与对照组相似，它们都由成纤维样变为棱形。由此可知，仅高浓度的nHA对细胞形态、骨架组装、生存力、粘附性都存在影响。同样，通过nHA浓度对BMSCs坏死和凋亡的研究，随着nHA浓度的增加，荧光强度越强，ROS的含量越高，细胞坏死越快，而早期细胞凋亡百分比却出现下降，晚期的细胞凋亡百分比变化不显著。这表明nHA颗粒仅对细胞坏死有影响，而不能诱导细胞凋亡。

4.3.3 钙磷离子对BMSCs矿化和生长的影响 由于细胞不能分泌过多钙磷离子用于形成磷酸盐和碳酸盐，以致细胞不能矿化。当向培养液中加入钙磷离子时，细胞的矿化程度随钙离子浓度的升高而增强，但对磷离子的浓度变化不显著。然而，升高磷离子浓度和降低钙磷离子浓度均能限制细胞生长，仅升高钙离子浓度时对细胞生长无影响。钙磷离子是细胞矿化的原材料，向培养液中加入钙磷离子，虽有利于成骨细胞的矿化[25]，但对细胞的生长有一定的影响。

4.3.4 BMSCs对nHA支架降解的影响 对染色区域经电子计算机断层扫描（CT）观察，随着复合时间的延长，骨形成区域面积随之增加，支架区域面积随之减少，且支架的降解速率与骨形成的速度成正相关。由此可知，BMSCs可促进支架的降解[18]。同时nHA的孔壁厚度逐渐减小，孔径逐渐变大，最终孔破裂，nHA支架消失。经研究得出如下两方面原因：（1）外源植入物导致肌肉损伤后，参与其中炎性反应的酶和细胞产生的氧自由基和超氧阴离子能加速生物材料降解[26]。（2）成骨和血管的协同作用可促进支架降解，它们通过招募本地的巨细胞去侵蚀和吸收支架，同时增加血液供应，清除代谢产物[27]。

然而，目前骨组织工程支架材料体内降解的确切机制尚不清楚，且降解速度比较慢，时间比较长。BMSCs在复合材料上能够生长、增殖、分化、坏死、凋亡和矿化的确切机制和信号通路也尚不被熟知。由于骨组织工程技术和方法尚未显现出更大的突破，支架材料的研究仍停留在体外实验和动物体内实验，临床上的研究还不成熟。

5 展望

BMSCs的自我复制和多向分化潜能为二者的复合奠定了基础，nHA的特性为二者的复合提供了良好条件。collagen I、osteocalcin、osteopontin和碱性磷酸酶（ALP）的表达量以及钙结节的形成，为BMSCs的成骨分化和矿化提供了检测指标。nHA的孔径和孔隙率不仅是良好nHA支架材料的重要评定参数指标，而且nHA合适的浓度、孔径和孔隙率也为细胞的附着和生长提供了重要的先决条件。与微米级HA相比，nHA不仅具有更好的生物相容性、生物活性和骨传导性，还能促进BMSCs的增殖。希望在不久的将来，研究者能研制出更好的仿生nHA骨修复材料，广泛应用于临床。