同型半胱氨酸电极的研制及其测定性能研究

江书庆，薄惠，刘宽浩，李锟

（黄河科技学院医学院，河南 郑州450063）

1 引 言

同型半胱氨酸（HCY），或称为高半胱氨酸，是氨基酸半胱氨酸的异种。同型半胱氨酸在体内由蛋氨酸脱甲基生成，一旦生成，同型半胱氨酸在酶的催化下或者不可逆地通过脱硫作用异化为半胱氨酸，或者重新甲基化生成蛋氨酸。人体每天合成的同型半胱氨酸为15～20 mmol，但其中的大多数转化为半胱氨酸，或者在胱硫醚β合成酶的作用下转化为蛋氨酸。血浆中同型半胱氨酸的正常浓度在5～15 μmol／L，15～30μmol／L为稍高于正常值，30～100 μmol／L为中等高值，超过 100μmol／L即为严重超标。

血液中同型半胱氨酸浓度的升高容易引起下列几种疾病：（1）与身体机能的失调有关疾病，如神经管缺陷、妊娠综合症、精神错乱、老年精神问题、癌症、高胰岛素症[1-2]。（2）心血管疾病，同型半胱氨酸量的升高与动脉粥样硬化血管和动脉粥样血栓化血栓有直接的关系[3-6]。因此，目前在临床上逐渐加强了对人体血液中同型半胱氨酸的测定。

现阶段同型半胱氨酸的测定方法主要有气相色谱 -质谱联用法[7]、液相色谱 -质谱联用法[8]、高效液相色谱法[9]、毛细管电泳法和免疫分析法[10-11]。在这些方法中，色谱-质谱联用技术能够提高其准确度和灵敏度，但所需要的设备非常昂贵。免疫分析是近几年发展最快的方法，但开发周期长，成本非常高。这些方法作为实验室检测的标准方法具有一定的应用价值，但检测成本太高。如果能在基层医院、社区门诊开展同型半胱氨酸的测定，使同型半胱氨酸的测定成为监控老年人身体状况的一个指标，对预防心脑血管疾病具有十分重要的社会意义。所以在此基础上，我们研究开发了同型半胱氨酸分子印迹电极，能够快速、准确地检测同型半胱氨酸。

2 仪器与试药

饱和甘汞电极、211型玻璃电极（上海伟业仪器厂），pHS-3C型精密酸度计（上海理达有限公司）；TU-1810型紫外可见分光光度计（北京普析仪器公司），电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）。同型半胱氨酸、α-甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）、偶氮二异丁腈（AIBN）购于阿拉丁试剂有限公司，二硫代苏糖醇（DDT）购于德国Ruibio，其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

3 方法与结果

3.1 Hcy分子印迹模板的制备

精密称取0.1352 g（1 mmol）Hcy溶于10 ml甲醇-乙酸（1：1）混合液中，再加入 0.3444 g（4 mmol）α-甲基丙烯酸功能单体，在20 ml试管中超声1 h，使Hcy与功能单体充分作用，再加入7.9288 g（40 mmol）EDMA交联剂和20 mg引发剂 AIBN，然后向该溶液中通氮气5 min，真空下密封试管，并将其放入60℃水浴中加热24 h，得白色块状聚合物。经研钵研磨，过200目的筛，用甲醇-乙酸（1∶1，V／V）混合液洗至滤液用紫外分光光度计检测不出Hcy为止，继续用 NaOH洗去乙酸，再用水洗去NaOH，最后用无水乙醇再洗3遍，放入真空干燥器中干燥至恒重，即得同型半胱氨酸分子印迹模板。

3.2 同型半胱氨酸分子印迹-玻璃涂层离子选择性电极的制备[12-13]

将玻璃电极在蒸馏水中浸泡48 h，用二次蒸馏水冲洗干净，再用无水乙醇冲洗吹干待用。

称取聚氯乙烯（PVC）粉0.20 g，用10 ml四氢呋喃溶解，再加电活性物质30 mg，邻苯二甲酸二丁酯0.20 ml，超声处理，使其分散均匀。将上述pH玻璃电极浸入到该液体中，缓慢取出，晾干后再浸入，如此反复多次，使玻璃电极表面均匀涂敷一层PVC膜，此即同型半胱氨酸分子印迹-玻璃涂层电极。

3.3 电极电位测量方法

先将电极在10-3mol／L的同型半胱氨酸溶液中浸泡活化2 h，用水冲洗后与饱和甘汞电极组成测量电池，连接离子活度计，测量水的空白电位值，待其稳定后即可测定电动势，采用标准曲线法测定同型半胱氨酸的含量。

4 讨论

4.1 电活性物质的选择

比较空白印迹模板、未洗涤的聚合物和同型半胱氨酸分子印迹模板作为电活性物质进行测试，结果表明，空白印迹模板对同型半胱氨酸无明显的响应，未洗涤的聚合物作为电活性物质其响应性能弱于同型半胱氨酸分子印迹模板作为电活性物质的电极，所以，本研究选择同型半胱氨酸分子印迹模板为电活性物质制备的电极进行研究。

4.2 pH值的选择

用HCl和NaOH溶液调节1.0×10-4mol·L-1的同型半胱氨酸溶液的pH值，测量溶液在不同pH值下的电极电位E，作E～pH曲线见图1。由图1可知，当同型半胱氨酸溶液pH值为2.2～3.2，电极电位变化较小。为了便于控制溶液的pH值，选择pH2.7作为测定溶液的pH值。

图1 pH值的影响Fig 1 Effect of pH on the electrode response

4.3 电极Nernst响应曲线

依次测量同型半胱氨酸的浓度在1×10-2mol／L～1×10-6mol／L标准溶液的电位值E，以电位值E对同型半胱氨酸的溶液的pC做图，见图2。可知，同型半胱氨酸的浓度在5×10-3mol／L～5×10-5mol／L，E～pC具有良好的线性关系，该曲线的线性方程为：E＝49.0 pC-352.1，r＝0.9992。

图2 电极响应曲线Fig 2 Response curve

4.4 电极的选择性

采用等浓度溶液法测定一些常见氨基酸的选择性系数，结果见表1。由表1可知，常见的氨基酸对测定无显著性干扰，特别是L-半胱氨酸。

表1 常见氨基酸的选择性系数Table 1 The selectivity coefficient of common amino acids

4.5 电极使用寿命

检测所制备的电极在3个月内的Nernst响应性能，结果表明，试验期间电极的响应性能无显著性变化。则电极使用寿命大于3个月。

4.6 回收率实验

取在鼠全血 1 ml，15μl EDTA-Na2（7.5%）抗凝，20℃离心（2500 r／min）20 min，分离血浆。取200μl血浆，再加入0.3 mol／LHClO4工作液800μl沉淀蛋白，加入1 ml EDTA-Na2（7.5%）配合金属离子10 min后，分别加入2.00、5.00、10.00 ml HCY标准溶液，再加入加50μl新鲜配制0.05 mol／L DTT溶液，室温放置还原20min，定量转移至25ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。按方法2.2.3进行回收率实验，平均回收率为101.3%，RSD为2.71%（表2），该方法的准确度和精密度均较为满意。

表2 回收率测定结果Table 2 Recovery cletermination results

我们研究、开发的同型半胱氨酸分子印迹电极，能够快速、准确地检测，对预防心脏血管疾病有十分重要的意义。