浅析纳豆激酶固体发酵条件优化

臧学丽，李亚芹，曾凤英

（长春医学高等专科学校，吉林长春 130031）

浅析纳豆激酶固体发酵条件优化

臧学丽，李亚芹，曾凤英

（长春医学高等专科学校，吉林长春 130031）

文章主要研究产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌的固体发酵条件优化。优化接种量、培养温度、时间及纳豆的蒸煮时间等影响纳豆激酶产量的因素。试验结果表明，接种量为8%，培养温度为37℃，纳豆激酶产量达到最高。经过条件的优化酶活达到4 080 U/g，为进一步的发酵研究提供依据。

纳豆激酶 固体发酵 枯草芽孢杆菌

纳豆激酶（Nattokinase，NK）是由纳豆枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto，BSN ）产生的1种碱性丝氨酸蛋白酶。它能够溶解体内的血栓，并能够明显地缩短优球蛋白的溶解时间（ELT）[1]。纳豆激酶不但能直接作用于纤溶蛋白，还能激活体内纤溶酶原，加强内源性纤溶酶的作用效果，从而更有效地发挥溶栓性能[2]。与其它的传统溶栓药物相比，纳豆激酶具有特异性强、安全[3]、价格低廉、可以口服吸收、在体内半衰期长等优点[4]，是一种具有开发潜力的溶栓药物。文章对产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌固体发酵条件进行优化，使纳豆激酶的酶活性得到了很大的提高。

1 材料与方法

1.1 材料

实验菌株：纳豆枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto，BSN），长春医学高等专科学校生工实验室保藏。

1.2 方法

1.2.1 纳豆激酶活性测定

纤维蛋白平板法[5]（参照Astrup法）。

1.2.2 纳豆中纳豆激酶活力测定

称取黄豆500 g，洗净加入2.5倍水，浸泡过夜，分装到250 ml三角瓶中，121℃高压灭菌0.5 h，自然冷却至50℃时以8%的接种量接上种子液，在37℃条件培养25 h。称取纳豆50 g，加入100 ml生理盐水，浸泡30 min，5 000 r/min离心10 min，取上清液稀释一定的倍数，采用纤维蛋白平板法测定酶活。

1.2.3 纳豆枯草芽孢杆菌固体发酵条件优化

（1）不同接种量对纳豆枯草芽孢杆菌产酶的影响。在接种量为4%、6%、8%、10%和12%的条件下分别测定纳豆枯草芽孢杆菌发酵生产纳豆激酶的酶活。

（2）不同培养时间对纳豆激酶酶活的影响。在培养时间为20 h、22 h、24 h、26 h、28 h，分别测定纳豆激酶的酶活。

2 结果与讨论

2.1 接种量对纳豆激酶酶活的影响

试验结果表明，在接种量为8%时，酶产量达到峰值，酶活性达到4 020 U/g。原因可能为随着接种量的增加，发酵液中可产纳豆激酶的菌体数量逐渐增加。而在超过8%时，随着接种量的增加，酶活性逐渐降低，可能原因是在有限的营养环境中，随着发酵菌体的增加，对营养的竞争逐步激烈，大量菌体的存在抑制了酶的生产。

2.2 培养温度对纳豆激酶酶活的影响

试验结果表明，枯草芽孢杆菌最适的产酶温度为37℃，酶活性达到4 080 U/g。发酵温度较低时，酶活相对较低，达到产酶峰值时间较长，这无疑增加了生产成本。而在发酵温度较高时，酶活并未得到有效的提高，且过高的温度也会增加工业生产中的成本。

3 结论

该研究经过发酵条件的优化，酶活得到了大量的提高，与现代的高效理念相符。在接种量为8%，培养温度为37℃的条件下，纳豆激酶酶活达到4 080 U/g。

[1] 李淑英，赵仲麟，聂莹，等．纳豆激酶研究进展．中国农业科技导报，2013，（4）：139～143

[2] 程守强，梁凤来，王仁静，等．纳豆激酶的研究进展．微生物学杂志，2005，（2）：69～74

[3] He Ni，Peng-Cheng Guo，Wei-Ling Jiang，et al．Expression of nattokinase in Escherichia coli and renaturation of its inclusion body．Journal of Biotechnology，2016

[4] 逯京华，孙智杰．纳豆激酶的研究现状与展望．生物技术通报，2009，（8）：41～45

[5] Sumi，H．Experimentia，1987，43:1110～1111