三叶草的研究新进展

王亚茜，陈楠楠，林晶晶，黄俊逸，廖鲜艳（上海大学生命科学学院食品营养与功能研究室，上海200444）



三叶草的研究新进展

王亚茜，陈楠楠，林晶晶，黄俊逸，廖鲜艳*
（上海大学生命科学学院食品营养与功能研究室，上海200444）

摘要：三叶草被认为是目前最有开发前途的保健食品和医药新资源之一，也是目前食品保健、生物医学等领域的研究热点。主要介绍了目前国内外对三叶草主要活性成分、功能及其应用等方面的研究进展，并对其进一步的开发进行了展望。

关键词：三叶草；活性成分；抗氧化；抑菌

豆类是开花植物中第三大家族，对于食品工业和农业具有重要的作用。它包含727个大类和20 000个品种，三叶草属（Trifolium）是在豆类家族中最大的种属，有300个品种。三叶草广泛分布于两个半球的温带和亚热带地区[1]。三叶草又名车轴草，在我国分布广、栽培面积大。三叶草主要分为红三叶和白三叶。三叶草被东方和欧洲国家用于治疗湿疹和牛皮癣。在土耳其民间医药中，一些三叶草品种比如白三叶、红三叶，常被用于祛痰剂、镇痛剂、防腐剂和风湿疼痛[2]。

近年来，有关三叶草的研究日益受到重视，其粗蛋白含量高，且富含黄酮类化合物、钙、钾、镁、磷、维生素、烟酸等多种营养成分以及高富硒能力，成为三叶草在牧草、饲料、医药、保健食品等方面的开发亮点。介绍了三叶草的主要活性成分、功能及其在保健食品等方面的应用，以期为更好地开发利用三叶草提供参考。

1　三叶草中活性成分的分析

自20世纪60年代开始，人们对三叶草的活性成分及其功能与结构进行了大量研究，已从中分离鉴定了黄酮类、多糖、叶蛋白、挥发油等多类化合物，以下对几种活性成分进行了总结。

1.1黄酮类化合物

黄酮类化合物分布广泛，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗炎等活性。于丽娜等[3]通过单因素及正交试验优化了用超声波辅助法提取红三叶草全草中总黄酮的条件，并与醇提法进行了比较。正交试验结果显示，当超声功率为250 W、超声时间为40min、超声温度为70℃、溶剂浓度为60 %和料液比为1∶20（g/mL）时，红三叶草总黄酮含量为47.52 mg/g。相比于其它的植物，章华伟等[4]采用响应曲面法优化提取桑叶黄酮工艺条件，桑叶黄酮得率为23.7 mg/g。秦学会等[5]采用响应面法优化马齿苋黄酮的超声辅助提取条件，在此条件下黄酮得率为8.24 mg/g。由此可见，三叶草黄酮含量比桑叶和马齿苋黄酮含量都要高。

He等[6]从红三叶草中分离得到金丝桃苷（Hyperoside）、异槲皮苷（Isoquercitrin）和槲皮素（Quercetin）3种黄酮化合物。Foo等[7]从白三叶草中分离得到槲皮素、杨梅素（Myricetin）、异李鼠素（Isorhamnetin）及其这3种黄酮化合物的3-O-β-D - galactopyranoside糖苷和3-O-β-D - galactopyranosides -6- O-acetyl糖苷，共9种黄酮化合物。这些活性成分为其功能的发挥奠定了基础。

1.2活性多糖

活性多糖主要参与生物体的免疫调节，参与生命细胞的各种活动。20世纪50年代发现真菌多糖能够活化巨噬细胞刺激抗体产生，提高人体免疫能力，具备很强的抗癌作用。

欧阳克蕙等[8]采取热水浸提法提取白三叶草多糖，其最佳提取工艺参数为：提取时间5h，料液比1∶15（g/mL），温度100℃，浸提液pH为9，此条件下白三叶草多糖得率为2.26 %。红三叶草中的糖类物质主要有蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖和淀粉等[9]。

相比其它植物，王芳等[10]研究了酶处理后水提桑叶多糖为12.49 %。吴光杰等[11]利用响应曲面法对马齿苋多糖的提取条件进行优化。在此工艺条件下，马齿苋多糖得率达24.25 %。因此，三叶草中的活性多糖相比桑叶和马齿苋中的多糖含量偏低。

1.3叶蛋白

叶蛋白是调节植物体内渗透压和供给能量的重要成分，含有18种氨基酸，其中包括8种人体必需的氨基酸，且其组成比例平衡，与联合国粮农组织推荐的成人氨基酸模式基本相符。

熊春梅等[12]以叶蛋白提取率、蛋白质量分数为指标，对三叶草叶蛋白提取的最佳工艺参数进行了优化。正交试验表明，提取三叶草叶蛋白的最佳提取工艺为料水比1∶3（g/mL）、加盐量为5 %、pH为3.0、絮凝温度为70℃，含量高达14.36 mg/g。

赵国磊等[13]测得红三叶草中蛋白质含量约为干重的113 mg/g。此外三叶草中还含有各种必需的氨基酸，叶中以天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和甘氨酸8种氨基酸含量较高，花中以天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸3种氨基酸含量较高[14]。

王芳等[15]采用超声波提取桑叶叶蛋白，在最佳提取工艺下，桑叶叶蛋白含量为99.3 mg/g。高莉等[16]从马齿苋中提取叶蛋白，在最佳提取工艺提取叶蛋白的含量为9.5 mg/g。相比之下，三叶草中的叶蛋白含量最多，这也是它成为优质饲料的原因之一。

1.4叶绿素

叶绿素是一种天然色素，富含微量元素铁，是天然的造血原料，而且能有效预防感染，防止炎症的扩散。张志强等[17]用有机溶剂萃取法提取白三叶干草中叶绿素，通过对影响提取效率的各参数进行正交试验得出叶粉的最佳提取工艺为：用95 %乙醇按照1∶15（g/mL）的料液比于60℃恒温水浴中加热1 h，最佳提取条件下叶绿素的含量为70.35 mg/g。

曾家豫等[18]以红三叶鲜青草预加工废水为原料，研究了叶绿素的提取方法。首先，采用醇沉法沉降红三叶预加工废水中的有机物；其次，采用醇提法浸提沉淀物中的叶绿素，并通过单因素及正交实验对提取条件进行了优化。结果显示，从废水中沉降有机物的最佳乙醇浓度为30 %，固形物沉降率为39.45 %；从沉淀物中浸提叶绿素的最佳条件为乙醇浓度90 %、浸提温度60℃、浸提时间6 h和料液比1∶25（g/mL），叶绿素含量为1.72 mg/g。

陈绍瑗等[19]在最佳提取条件下获得桑叶叶绿素的含量为5.376 mg/g。相比之下，三叶草中的叶绿素含量要高于桑叶中的叶绿素含量。

1.5绿原酸

绿原酸具有多种药理作用，是许多中药材及中成药中起抗菌、消炎、解毒、利胆、降压、抗肿瘤、抗氧化和抗衰老的功效成分[20]。赵莹等[21]提取白三叶草中的绿原酸，并用高效液相色谱测定其中含量为7.46 mg/g，表明白三叶也是一种可开发的植物资源。戴开金等[22]用甲醇为提取剂，40min超声提取2次测定桑叶中绿原酸含量为2.05 mg/g，比三叶草中绿原酸含量略低。

1.6挥发性活性成分

许多植物的挥发性油用作精油的生产，其用途也非常广泛。不仅可以用于皮肤的杀菌、消炎，还具有降血压、祛痰、镇痉等作用。景书灏[23]以白三叶草为研究对象，提取了白三叶草的挥发油成分并进行GC-MS分析，并进行了抗菌活性测定和体外抗结核杆菌试验。试验结果表明，白三叶的挥发油成分具有抗细菌、真菌作用，并对结核杆菌有一定的抑制作用。白三叶中挥发性成分十分丰富，但我国对其挥发性物质的研究还处于探索阶段，有待进一步深入研究并开发出以其挥发性物质为主要成分的新产品。

2　三叶草的功能研究

2.1抗氧化功能

黄酮类物质是强抗氧化剂，是自由基的强清除剂。红三叶中的异黄酮和多酚化合物被认为是有效的抗氧化剂、自由基清除剂和功能食品增补剂，具有良好的生理健康促进作用[24-25]。

刘宝剑[26]对红三叶总黄酮抗氧化作用及其对免疫功能的影响研究发现，红三叶总黄酮能明显抑制过氧化氢诱导的红细胞溶血反应，且随着红三叶总黄酮浓度增加，其抑制作用逐渐增加。说明红三叶总黄酮在一定浓度范围内有抗氧化、抑制溶血的作用。杨丽珍等[27]研究发现红三叶黄酮通过提高衰老大鼠SOD（超氧化物歧化酶）活性，降低MDA（丙二醛）浓度，达到提高机体清除氧自由基能力，从而有效延缓衰老。

2.2富硒功能

硒是构成酶的活性成分，参与酶的催化反应；调节维生素的消化吸收；参与电子传递，调节机体代谢；抗氧化和清除自由基的功能；调节机体免疫力；影响人和动物的繁殖发育等。作为植物有机硒，其生物活性远远大于亚硒酸钠等无机硒[28]，三叶草因体内含有较高有机硒，因此具有了微量元素硒的部分生物学功能。

杨三东等[29]研究发现红三叶草是一种高富硒植物，经高硒栽培或生长于高硒地区的红三叶草含硒量可达15 μg/g左右，蛋白质、多糖和核酸结合硒是微量元素硒在红三叶体内的主要赋存形态，占总硒量的80 %以上，其中蛋白质硒占总硒的1/2以上。

2.3抑菌功能

石靖等[30]从三叶草等叶片中提取挥发性有机物，用菌落法和滤纸片法研究其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑制作用。结果发现三叶草叶片释放的挥发性有机物对3种细菌都有抑菌作用，且对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抑菌率分别达到了37.7 % 和11.3 %，但其抑菌物质的种类和性质等有待进一步探讨。

2.4营养（饲料）功能

谭剑蓉等[31]研究了不同比例的白三叶草粉对肉兔生长性能、消化代谢、屠宰性能、血液指标、消化酶活性、肠组织形态和盲肠内环境等方面的影响，结果表明在肉兔日粮中添加40 %的白三叶草粉，其营养物质的消化率最高，消化酶的活性最高。可见，三叶草粉对肉兔的生产性能和消化生理功能都是有利的。

四川农业大学把白三叶加入奶牛的日粮中以取代粗饲料，3 d即可提高0.87 %的产奶量，使净收益增加23.7 %～34.6 %。在禾本科牧草与白三叶混播的草地上放牧奶牛时，不但可以改善其健康和提高产奶量，犊牛断奶后还能够获得较高的日增重和受胎率，也可以相对减少产后瘫痪疾病[32]。给反刍动物饲喂红三叶草会提高多不饱和脂肪酸（PUFA）的含量，降低饱和脂肪酸的含量[33]。白三叶草地用于饲喂蛋鸡，可提高产蛋量和增加蛋黄色泽[34]，而且可有效节省粮食资源，缓解粮食危机。

2.5医药与保健功能

三叶草中的三萜皂苷有广泛的生物学性质，比如杀钉螺活性、抗炎、抗菌、免疫溶血、细胞毒性和抗肿瘤[35]。皂苷被广泛用于食品和饲料添加剂，对人体和动物的健康有益。

红三叶草异黄酮为植物雌激素，其结构类似于17-β-雌二醇，因此异黄酮能够连接雌激素受体（ERs），起到激素的作用[36]。人体补充红三叶草异黄酮可以预防和治疗激素分泌失调导致的一系列相关疾病。绝经后的妇女补充红三叶草异黄酮可以显著减轻更年期症状，并且对甘油三酯的水平有积极的影响[37]。Sabudak等[38]用异黄酮和雌二醇来抑制或预防妇女由于内源性雌激素减少而引起或加重的一些疾病。另外，红三叶草也能治疗雌激素病，如子宫肌瘤、子宫内膜异位及骨质疏松症等[39]。

植物来源的多糖对肠道健康有积极的作用，三叶草来源的多糖可以通过阻止肠道菌落的减少和降低疾病活性指数来抑制葡聚糖硫酸钠引起的小鼠结肠炎[40]。

3　应用与开发

3.1功能食品的研发

3.1.1主食品的开发

三叶草中富含粗蛋白、维生素和叶黄素，不含动物蛋白所含的胆固醇，可作为儿童和成人的食用蛋白源和食品添加剂[41]，被联合国粮食及农业组织认为是一种高质量食品，因此，应该加大开发力度。关于植物叶蛋白研究报道较多，郑建仙[42]将苜蓿叶蛋白应用到面条中，在添加量不超过4 %时，不改变面团流变学特性和口感；即使苜蓿叶蛋白的加入量达5 %，也不会影响面条的加工性能。三叶草叶蛋白与苜蓿叶蛋白都属于植物蛋白，同动物蛋白相比，植物叶蛋白成本低廉，在经济欠发达地区是一种理想的食品。叶蛋白对人体具有多种功能，它进入人们的膳食结构后，将会降低高胆固醇对健康的危害。

3.1.2副食品的开发

朱成凯等[43]以三叶草浸提液为主要原料，在配方优化的基础上，研制具有抗氧化及改善睡眠等保健功效的功能性饮料。该饮料有浓郁的三叶草清香，口感清爽，是一款有开发前景的功能性饮料。

夏咏梅等[44]将桑叶粉代替绿茶粉应用于抹茶蛋糕中，生产的抹茶蛋糕色泽鲜艳翠绿，甜度适中，茶香馥郁细腻。而且桑叶富含多种矿物质和氨基酸，具有降血压、调节血脂、延缓衰老、抑菌、美容等功效，已经被认定为“药食同源”的农产品，而且抑菌功效可以延长蛋糕货架期。

唐长波等[45]通过单因素试验和正交试验探讨桑叶保健饼干配方及生产工艺，确定桑叶保健饼干最佳配方。该配方生产的饼干呈均匀淡绿色、外形完整不变形、结构细密、口感酥松爽口并赋有桑叶特有清香，而且具有良好的营养和保健价值。有关三叶草在副产品上的开发较少，但是桑叶的开发利用可以为三叶草的开发提供一些借鉴，因而三叶草开发前景广阔。

3.2饲料添加剂的开发

白三叶是世界上分布最广的一种豆科牧草，初花期干物质粗蛋白含量高达24.7 %，纤维含量相对低于禾本科，矿物含量高于禾本科，富含氨基酸和多种维生素（VB、VC、VE、VK），具有高度易消化性、营养性及适口性[46]。

三叶草中含有丰富的叶蛋白，是猪、鸡、牛、羊良好的蛋白质补充饲料，对家畜适口性好、营养价值高、明显增加体重以及改善禽、畜、鱼、蛋等产品品质，具有良好的饲养效果，可作为家畜饲料添加剂，也可直接制成叶蛋白饲料直接进行饲喂。

3.3保鲜作用的应用

由于可能的毒副作用，苯甲酸钠和山梨酸钾等合成防腐剂已有逐渐被淘汰的趋势，而三叶草作为天然食品防腐剂的作用将使它具有较好的开发前景[47]。三叶草中的挥发性有机物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有较强的抑菌作用，因此可以开发作为天然食品防腐剂而加以开发与应用[48]。徐娜婷等[49]研究了枫香叶挥发油对枯草杆菌等的抑制作用，并将枫香叶挥发油应用于枇杷保鲜。结果表明，枫香叶挥发油对枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、霉菌均有抑制作用，并有利于枇杷保鲜。因此，三叶草也可采用同样方法。

3.4医药与保健功能的应用

三叶草中含有丰富的异黄酮、皂苷、多酚类化合物及活性多糖等功能性成份。市场上已出现了很多植物来源的保健品，如大豆异黄酮、人参皂苷Rh2胶囊、茶多酚胶囊、灵芝多糖胶囊等。目前，关于三叶草中的活性成分的功能与应用研究也越来越受到人们的关注，具有良好的市场潜力。

4　展望

随着人们对三叶草及其活性成分生理功能研究的不断深入，其应用领域将不断扩大。目前有关三叶草的应用主要集中在牧草、饲料、环境绿化等方面的初步应用，有待进一步深入。三叶草资源在我国十分丰富，应加强对其活性成分的开发利用，充分利用好三叶草丰富的黄酮和有机硒资源，研发出对人体有利的功能食品。三叶草硒化合物在人和动物补硒方面的应用研究、如何更好地利用三叶草中的活性成分等等，都是目前我们需要解决的问题，这将为我们研究开发出更多的以三叶草活性成分为原料的保健食品和医药产品提供理论和试验参考，产生良好的社会效益和经济效益。

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The New Research of Trifolium

WANG Ya-xi，CHEN Nan-nan，LIN Jing-jing，HUANG Jun-yi，LIAO Xian-yan*
（Laboratory of Food Nutrition and Function of School of Life Sciences，Shanghai University，Shanghai 200444，China）

Abstract：Trifolium is considered to be the most promising health food and medicine，which are also hotpots in the field of food health care and biological medicine，etc.This article summarized the research progress on the main active components and pharmacological action of trifolium，reviewed its applications in health food and pharmaceutical，and forecast its further application as well.

Key words：trifolium；active components；antioxidant；antibacterial

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.046

基金项目：大学生创新项目（上海大学）

作者简介：王亚茜（1990—），女（汉），硕士，研究方向：食品科学。*通信作者：廖鲜艳（1975—），女，副教授。

收稿日期：2014-10-21