银杏叶提取物对睡眠剥夺小鼠学习记忆能力的影响及其机制的研究

唐梦晨　陈娇　徐文杰　李凌

[摘要] 目的 研究银杏叶提取物（EGB）对睡眠剥夺小鼠学习记忆能力的影响及其机制。 方法 选取成年健康清洁级小鼠48只，雌雄各半，根据随机数字表法将小鼠随机分为4组（n=12）：空白组，对照组，治疗Ⅰ组，治疗Ⅱ组，适应性饲养3天，每组筛选出9只进行造模。应用72 h睡眠剥夺法制作动物模型，用Y迷宫成绩（正确反应次数）评定学习记忆能力，免疫组织化学法反映小鼠海马脑源性神经营养因子（BDNF）的蛋白表达。 结果 Y迷宫测试结果显示，给药后，对照组与治疗Ⅰ组、对照组与治疗Ⅱ组的正确反应次数差异有统计学意义（P<0.05）；对照组给药前后的正确反应次数差异有统计学意义（P<0.05），其余3组差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组比较，空白组、治疗Ⅰ组、治疗Ⅱ组海马区的BDNF表达增高，其灰度值差异有统计学意义（P<0.05），但空白组、治疗Ⅰ组、治疗Ⅱ组各组间的灰度值差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 睡眠剥夺能造成脑损伤、学习记忆能力减退以及BDNF表达减少，EGB可能是通过上调BDNF蛋白及其相关通路蛋白改善睡眠剥小鼠的学习记忆能力。

[关键词] 银杏叶提取物；睡眠剥夺；脑源性神经营养因子；学习记忆

[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）02（c）-0004-04

[Abstract] Objective To study the influence extract of Ginkgo biloba （EGB） on learning and memory ability in sleep-deprivation mice and its mechanism. Methods Forty-eight healthy and clean adult mice were selected，half male and half female，and they were evenly divided into 4 groups according to the random number table method：blank group，control group，treatment groupⅠ， and treatment group Ⅱ，and they were given adaptive feeding for 3 days，9 mice were selected in each group to make model.72-hour of sleep-deprivation method model was applied.The learning and memory ability was evaluated by achievement of Y maze.The protein expression of brain-derived neurotrophic factor （BDNF） in hippocampal area in mice was reflected by immunohistochemistry. Results Test result of Y maze showed that，after administration，there was a statistical difference of right reaction times between control group and treatment groupⅠ，and between control group and treatment groupⅡ （P<0.05）；there was a statistical difference of right reaction times before and after administration in control group （P<0.05），the other three groups had no statistical difference （P>0.05）.Compared with control group，BDNF expression of hippocampal area in blank group，treatment group Ⅰ，and treatment group Ⅱ was improved，and there was a statistical difference of gray value （P<0.05），however，there was no statistical difference of gray value among all groups （blank group，treatment group Ⅰ，and treatment group Ⅱ） （P>0.05）. Conclusion Sleep-derivation can lead to cerebral damage，decreased learning and memory ability，and reduction of BDNF expression，and EGB may improve learning and memory in sleep-deprivation mice by up-regulating BDNF protein and its related pathway protein.

[Key words] Extract of Ginkgo biloba；Sleep-deprivation；Brain-derived neurotrophic factor；Learning and memory

睡眠剥夺（sleep deprivation，SD）一般指在24 h中的睡眠<4 h，可以引起生理，心理甚至行为的变化[1]。机体处于正常睡眠状态下，脑内某些蛋白增加，对新突触的建立及学习记忆有很大的促进作用[2]。有研究[3]表明，中长期SD大鼠前额叶皮质脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）免疫阳性物质表达显著减少，可造成脑损伤，影响学习记忆能力。研究[4]表明，BDNF直接参与学习的可塑性，是管理和存储记忆的动力学因素，可能是调控学习和记忆的一个重要分子标志物。在成年中枢系统，BDNF的表达受很多因素的调节，同时通过调节突触的可塑性影响学习记忆[5]。大量研究[6]表明，在正常脑中生理剂量的BDNF对学习记忆有促进作用。

银杏叶提取物（extract of Ginkgo biloba，EGB）已被国内外用于改善脑功能不全患者的学习记忆能力， 是一种 “认知增强剂”[7]。 据报道[8]，EGB具有提高内源性BDNF表达水平的作用，作用机制有待进一步研究。那么，EGB能否改善SD小鼠的学习记忆能力，目前尚无报道。

本研究拟采用行为学、免疫组织化学法等，一方面研究EGB对SD小鼠学习记忆能力的影响，另一方面研究EGB对SD小鼠海马BDNF的影响，进而揭示其可能的作用机制，为寻找能改善SD对学习记忆能力影响的方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取成年健康清洁级小鼠48只，雌雄各半，体质量为（23±2）g，由徐州医学院动物中心提供。饲养于相对湿度在30%～40%的动物房，光照节律为12L∶12D（8：00～20：00），温度为（25±1）℃。根据随机数字表法将小鼠随机分为4组，每组12只，分别为空白组，对照组，治疗Ⅰ组，治疗Ⅱ组。适应性饲养3 d，期间进行站台训练，每天训练30 min，可自由饮水及进食，避免噪声。每组筛选出9只训练合格的小鼠进行造模。

1.2 迷宫训练

实验时先将小鼠放入迷宫适应3 min，灯亮时该臂有电，小鼠受电击后逃到安全区，此区内无灯光。灯光持续10 s后，随机变化电击区，进行下一次测试。每个实验日连续测试20次，记录正确反应次数，所用参数：电压为50～70 V，延时5 s。各组造模前3天进行每天20次的训练，取第3天成绩作为造模前成绩（正确反应次数）；给药后再进行测试。

1.3 动物模型制备

应用改良多平台睡眠剥夺法（modified multiple platform method，MMPM）（72 h睡眠剥夺法）制作动物模型：各组从造模第1天，8：00 开始放入睡眠剥夺箱，连续3 d，至第4天早8：00结束。用大鼠笼[规格：48 cm（长）×40 cm（宽）×34 cm（高）]自制简易睡眠剥夺箱，其底面均匀固定9个上表面积2.5 cm×2.5 cm的木平台。箱内注水，平台高出水面0.5 cm，水温保持在室温24～26℃。箱顶置铁丝网。每天更换箱中的水。

1.4 主要药品与试剂

银杏叶片（每片含总黄酮醇苷19.2 mg，萜类内酯4.8 rag，批号：20070403）：贵州信邦制药股份有限公司；BDNF试剂盒：武汉博士德；SABC（兔IgG）：武汉博士德；PBS液：北京中杉金桥；DAB显色剂：武汉博士德。

1.5 实验处理

空白组：正常睡眠，等量去离子水灌胃5 d；对照组：睡眠剥夺，等量去离子水胃5 d；治疗Ⅰ组：睡眠剥夺，EGB 9 ml/10 g灌胃5 d；治疗Ⅱ组：睡眠剥夺，EGB 18 ml/10 g灌胃5 d。给药后第6天开始再次分别对4组小鼠进行行为学检测。

1.6 免疫组织化学检测法

造模结束，经行为学检测，麻醉成功后，将小鼠仰卧固定于手术板上，剪开前胸壁肋骨，暴露心脏，小心分离出升主动脉并在其下穿1根1号手术线备用，将灌注针从心尖插入升主动脉，用准备好的手术线将灌注针固定于升主动脉，在左心耳剪1个小口，输液器接于灌注针尾部，止血钳夹闭腹主动脉，小鼠头低脚高位，快速灌注生理盐水直至流出液变清，再以4℃的4%多聚甲醛继续灌注，直至小鼠头颈变硬，快速断头取脑，取海马，连续冠状切片，PBS漂洗3次，3 min/次，去离子水冲洗；以3%过氧化氢溶液孵育20 min，PBS漂洗3次，3 min/次；正常羊血清封闭（3∶200，37℃，15 min）；倾去血清，勿洗，滴加一抗（BDNF兔来源）（1∶60，4℃过夜），PBS漂洗3次，3 min/次；滴加二抗（1∶200，37℃），孵育10 min，PBS漂洗3次，3 min/次；滴加AB液（1∶100， 37℃，40 min），PBS漂洗3次，3 min/次；DAB显色（1∶20）；最后进行梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片，晾干后进行镜下观察、拍照。蛋白表达相对量以灰度值表示。各组随机选取3只小鼠，每只小鼠随机选取3个部位，每个部位9个视野，应用ImageJ软件进行图像分析。

1.7 统计学处理

采用SPSS 13.0软件分析，Y迷宫成绩、海马内BDNF蛋白含量用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（One Way-ANOVA）检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组小鼠给药前后正确反应次数的比较

Y迷宫测试结果显示，对照组给药前后的正确反应次数差异有统计学意义（P<0.05），其余3组差异无统计学意义（P>0.05）；给药后，对照组与治疗Ⅰ组、对照组与治疗Ⅱ组的正确反应次数差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

2.2 4组小鼠BDNF免疫组织化学染色结果的比较

免疫组织化学染色结果显示，BDNF主要表达于海马细胞的细胞质和细胞膜，呈棕黄色的为阳性。对照组与空白组比较，BDNF蛋白表达明显减少（图1A、图1B）。与对照组比较，空白组、治疗Ⅰ组、治疗Ⅱ组海马区的BDNF表达增高（图1A～图1D），其灰度值差异有统计学意义（P<0.05），但空白组、治疗Ⅰ组、治疗Ⅱ组各组间灰度值差异无统计学意义（P>0.05）（图1A、图1C、图1D）（表2）。

2.3 SD开始前后4组小鼠精神状况与活动能力的比较

SD开始前，4组小鼠饲养条件一致，精神状况与活动能力基本一致，体重持续增长。SD开始后，对照组、治疗Ⅰ组、治疗Ⅱ组精神萎靡、活动减少，且情况持续加重。SD 72 h，36只小鼠均存活。

3 讨论

本实验中，Y迷宫测试结果显示，对照组给药前后的正确反应次数差异有统计学意义，说明SD会造成小鼠学习记忆障碍[9]。给药后，对照组与治疗Ⅰ组、对照组与治疗Ⅱ组的正确反应次数差异有统计学意义，说明EGB对SD小鼠学习记忆有改善作用。

免疫组织化学染色结果显示，EGB可能促进海马BDNF的表达。小鼠海马BDNF的表达增高，对小鼠学习记忆有保护作用；EGB可改善SD小鼠学习记忆障碍，可能是通过上调海马BDNF表达引起的。由此可推测，EGB对改善SD患者的学习记忆障碍有一定作用[10]。目前的研究证实，一定剂量的EGB对认知功能具有改善作用[11-12]。

德国神经生物学家Barde等[13]于1982年首次从猪脑中发现BDNF，目前研究发现，BDNF广泛存在于脑内各个区域，以海马和皮质居多，与疼痛[14]、抑郁[15]、学习记忆[16]等相关，而越来越多的研究[17-19]证实，BDNF在学习记忆中占至关重要的地位，可能与长时程增强（LTP）有关。

本实验中还发现，SD小鼠虽精神萎靡，但攻击性增强，可能处于应激状态。有研究表明[20]，长期应激可使下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）高激活，进而导致体内糖皮质激素异常增高，与海马内存在的大量糖皮质激素受体选择性结合，从而导致海马结构异常。

综上所述，EGB可以保护SD小鼠海马区神经细胞，上调海马区BDNF的表达，提高小鼠的学习记忆能力，且EGB安全性好，无明显毒副作用，来源充足，价格低廉，因此，EGB可以作为改善SD学习记忆能力的药物，值得进一步临床研究。不同剂量EGB对改善SD小鼠学习记忆能力的效果也可作相关研究。

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（收稿日期：2015-09-18 本文编辑：许俊琴）