一株芽孢杆菌溶磷动力学研究

刘　冬，陶　涛，李　萍，高智谋，毕璋友，姜晓斌，叶　明

(1.安庆职业技术学院 园林园艺系，安徽 安庆 246003；2.安徽农业大学 生命科学院，安徽 合肥230036；

3.合肥工业大学 生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009)



一株芽孢杆菌溶磷动力学研究

刘冬1,2，陶涛3，李萍1，高智谋2，毕璋友1，姜晓斌1，叶明3

(1.安庆职业技术学院 园林园艺系，安徽 安庆 246003；2.安徽农业大学 生命科学院，安徽 合肥230036；

3.合肥工业大学 生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009)

摘要：将1株具有溶磷能力的芽孢杆菌P8接种于以磷酸钙为唯一磷源的液体培养基中，对其降解磷酸钙效果及动力学进行研究。结果表明，该菌株具有稳定的溶磷活力，芽孢杆菌P8降解磷酸钙动力学方程遵循零级反应。提高培养基中葡萄糖或磷酸钙的初始浓度，均能提高芽孢杆菌P8降解磷酸钙的速率。

关键词：芽孢杆菌；溶磷；动力学

磷是植物生长所必需的矿质元素，磷营养不足会导致作物减少产量[1]。目前，在生产中多施用高水溶性磷肥，然而磷肥施入土壤后易形成难溶性的磷酸盐并迅速被土壤矿物吸附固定，而且大量长期使用化肥，还会造成诸如土壤板块等环境问题[2]。因此，在这种情况下迫切需要寻找一种更环保、更有效的方法解决由磷酸盐导致的土壤板块问题。

解磷微生物能将土壤中难溶性磷转化可溶性磷。土壤中难溶性磷可分为两类，一类是磷酸盐或结构复杂的磷灰石等无机磷酸盐，另一类是核酸、磷脂和植素等含磷有机物。对于前者，解磷微生物主要通过代谢活动产生有机酸促使磷酸盐溶解[3]。对于后者，解磷微生物主要通过分泌植酸酶、核酸酶和磷酸酶将其分解[4]。芽孢杆菌属中某些细菌具有较强的解磷能力[5]，本研究以一株具有较强解磷能力的芽孢杆菌P8为研究对象，对其降解磷酸钙动态过程进行研究。

1材料与仪器

1.1材料

供试菌株为芽孢杆菌P8(Bacillus.sp P8)，由合肥工业大学微生物资源与应用实验室筛选和保藏。培养基a：Ca3(PO4)2 4 g，葡萄糖 10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，KCl 0.2 g，MnSO41 mL(0.004 g·L-1)，FeSO4(Fe·EDTA)0.1 mL(0.002 g·L-1)，蒸馏水1000 mL，pH 7.0±0.2。培养基b：磷酸钙浓度为10 g·L-1，其他条件同培养基a。培养基c：葡萄糖浓度为15 g·L-1，其他条件同培养基a。试验中如无特殊说明，均使用培养基a进行相关研究。

1.2主要试验仪器

KQ118超声波细胞破碎仪；SW-CJ-1F双面无菌操作台；TGL-16C飞鸽离心机；DZF-6021真空干燥箱；分析天平；SHY-2A水浴恒温振荡器等。

2方法

2.1 摇瓶培养

在盛有30 mL培养基的100 mL三角瓶中，接种1 mL菌体悬浮液(将在牛肉膏蛋白胨上培养24 h的细菌刮入无菌水中，制备成菌体悬浮液，菌数约为106cfu·mL-1)，同时做空白对照(在未接种培养基中加入1mL无菌水)，在30℃，140r·min-1条件下培养，并每隔24 h取出2瓶测定(含对照)，共测定9次。

2.2磷酸钙浓度及降解率测定

将培养液(培养基初始磷酸钙浓度记为c)摇匀，吸取1 mL浑浊液于1.5 mL离心管(已称重，记为m1)，在10000 r·min-1条件下，离心15 min，并将沉淀离心洗涤(加1 mL蒸馏水)2次，放入30℃真空干燥箱，真空干燥24 h，称重(记为m2)，则磷酸钙降解率η为：

2.3葡萄糖、可溶性磷和生物量的测定

以DNS法[6]测定葡萄糖量，采用稀释平板涂布法[7]测定生物量；磷含量用钼锑抗比色法[8]测定，以上试验均做3次重复。试验数据采用Orgin 7.5和SAS 9.1进行统计分析。

3结果与分析

3.1降解率与溶磷量的关系

由图1可知，对溶磷量与降解率进行线性拟合，得R=0.8633，p=0.0027<0.01，故溶磷量与降解率相关性显著。而发酵液中的溶磷量虽与降解率均呈上升趋势，但24 h、48 h时其溶磷量分别为-11.61 mg·L-1、-6.23 mg·L-1，这可能是因为细菌在生长繁殖时，不仅分解难溶性的磷化合物，而且还同化一部分分解出来的磷，当后者作用大于前者时，使得有效磷含量低于对照值，反之则高于对照值，故菌株溶磷活力是稳定的。

图1　降解率与溶磷量的相关性分析

3.2降解率与生物量、葡萄糖的关系

由图2可知，在菌体快速增殖期(发酵前4 d)，葡萄糖浓度迅速降低，磷酸钙降解率迅速提高，在此阶段，磷酸钙降解率达到38.12%。

图2　降解率与生物量、葡萄糖的关系

4 d后，由于葡萄糖等营养物质的减少，菌体生长进入衰退期，菌体数目逐渐减少，但降解率依然呈上升趋势，这可能是因为菌体在快速增殖期，分泌出的大量有机酸[3,5]与钙等离子结合，使磷酸盐中的磷酸根释放出来，快速降解磷酸钙；而在衰退期，随着菌体数目的减少，有机酸类物质亦减少，降解磷酸钙速度降低。

以降解率为横坐标，生物量、葡萄糖浓度分别为纵坐标，进行拟合发现，葡萄糖浓度与降解率关系显著，其相关系数R值为-0.9161，P<0.01，而生物量与降解率的相关系数R为-0.1950，p=0.6151>0.05，生物量与降解率关系不显著。故以下试验考察不同初始葡萄糖、磷酸钙浓度条件下该菌株对磷酸钙的降解作用。

3.3磷酸钙降解动力学

对于一般生化反应速率可用式(1)表示[9]。

(1)

式(1)中，V为反应速率，Vm为最大反应速率，C为底物浓度，K为半饱和速率常数。当C<

(2)

V=Vm(3)图4芽孢杆菌P8降解磷酸钙动力学曲线

降解过程为零级反应，速率常数为k0=Vm根据式(2)和(3)分别求得底物与时间的关系式，lnC=a+k1t (一级反应) ；C=b+k0t(零级反应) 。

表1　芽孢杆菌P8降解磷酸钙动力学方程

由图4及表1可知，将芽孢杆菌在培养基a、b、c中培养，其对磷酸钙的降解均能较好地用零级反应形式表示，即磷酸钙以恒定的反应速率降解，式(3)表示的动力学表达式应与初始浓度无关。而试验中，其降解速率常数却受初始磷酸钙浓度、葡萄糖浓度的影响。当磷酸钙初始浓度由4 g·L-1升高到10 g·L-1时(初始葡萄糖浓度不变)，磷酸钙的降解速率约提高一倍，可能是由于磷酸钙释放的有效磷量随其浓度提高而增加，这在一定程度上减弱了磷对细菌生长的限制，使细菌快速生长并在代谢过程中迅速将难溶性磷转化为有效磷，同时葡萄糖为芽孢杆菌P8生长所必需的碳源和能量，故当葡萄糖初始浓度由10 g·L-1升高到15 g·L-1时(初始磷酸钙浓度不变)，磷酸钙的降解速率亦有提高。

将D值定义为芽孢杆菌P8降解磷酸钙的降解率为90%时所需时间[10]，芽孢杆菌P8降解磷酸钙的效果采用类比分析方法并以D值大小来比较。

表2　芽孢杆菌P8降解磷酸钙D值

注：X和Sx分别表示为平均值和标准偏差，a表示在p<0.01时各处理间差异显著。

由表2可知，在相同培养条件下，提高葡萄糖或磷酸钙的初始浓度(限于试验浓度范围)，均能提高芽孢杆菌P8降解磷酸钙的效率。

4结论

芽孢杆菌P8具有稳定的溶磷活力，其降解率与生物量之间无显著关系。在培养基a、b、c中，芽孢杆菌P8降解磷酸钙动力学方程遵循零级反应。在相同培养条件下，提高葡萄糖或磷酸钙的初始浓度(限于试验浓度范围)，均能提高芽孢杆菌P8降解磷酸钙的速率。

参考文献：

[1]Hameeda B, Harini G O P Rupelab S P, et al. Growth promotion of maize by phosphate-solubilizing bacteria isolated from composts and macrofauna[J]. Microbiology Research, 2008(163):234-242.

[2]Vassilev N, Vassileva M. Biotechnological solubilization of rock phosphate on media containing agroindustrial wastes[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2003(61):435-440.

[3]Feng K, Lu H M, Sheng H J, et al. Effect of organic ligands on biological availability of inorganic phosphorus in soils[J]. Pedosphere, 2004, 14(1):85-92.

[4]Trolldenier W D. Uptake of P from apatite by Pinus sylvestris seedlings colonized by different ectomycorrhizal fungi[J]. Plant Soil, 2000(218):249-256.

[5]Fernández L A, Zalba P, Gómez M A, et al. Phosphate-solubilization activity of bacterial strains in soil and their effect on soybean growth under greenhouse conditions[J]. Biology and Fertility of Soils, 2007(43):805-809.

[6]张成明, 姜立, 李十中. 酸水解对DNS法测定甜高粱中总糖的影响[J].农业机械学报, 2014 (9):200-204 .

[7]薛邦玉，许坤，赵云焕. 直接药敏试验在肉鸡生产中的临床应用意义[J].信阳农林学院学报, 2014(4): 92-100.

[8]柯春亮，陈宇丰，周登博, 等. 香蕉根际土壤解磷细菌的筛选、鉴定及解磷能力[J].微生物学通报, 2015(6): 1032-1042.

[9]张秀霞, 吴伟林, 单宝来，等. 固定化降解菌Q5降解喹啉动力学[J].石油学报, 2009, 25(6)：442-446.

[10]Osman E. Hypochlorite inactivation kinetics of Listeria monocytogenes in phosphate buffer[J]. Microbiology Research, 2004(159)：167-171.

(编辑：严佩峰)

The Study on Phosphate Solubilizing Kinetics of a Bacillus

LIU Dong1,2, TAO Tao3, LI Ping1, GAO Zhi-mou2,BI Zhang-you1, JIANG Xiao-bin1, YE Ming3

(1.Department of Landscape and Horticulture, Anqing Vocational&Technical College, Anqing 246003, China;2.School of Life Sciences, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China；3.College of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Abstract：One strain of Bacillus sp.P8 with phosphate-solubilizing ability was inoculated in the liquid mediums using calcium phosphate as the sole phosphate source. The effect and kinetics of calcium phosphate degradation (CPD) by Bacillus sp.P8 was studied. Results showed that the phosphate-dissolving activity of Bacillus sp. P8 was stable. The CPD followed the zero-order model. When the initial calcium phosphate or glucose concentration increased, the CPD rate increased.

Keywords：Bacillus sp；phosphate-solubilizing；kinetics

中图分类号：S154.3

文献标识码：A

文章编号：2095-8978(2016)01-0096-04

作者简介：刘冬(1982—)，男，安徽淮北人，讲师，在读博士，研究方向：农业微生物.

基金项目：安徽省高等学校省级自然科学研究重点项目(KJ2014A148，KJ2015A368)；安徽省重大教学改革研究项目(2015zdjy181)；安徽省教坛新秀(2015jtxx157)

收稿日期：2015-11-28