两种方法测定茶叶中游离氨基酸含量的比较研究

陈　义，张秀清,李玉霞，郭红萍

(1.信阳农林学院茶学系，信阳市茶产业基础研究重点实验室，河南 信阳 464000；

2. 光山县净居寺茶场，河南 信阳 464000；3. 光山县净居寺名胜管理区，河南 信阳 464000)



农业科学

两种方法测定茶叶中游离氨基酸含量的比较研究

陈义1，张秀清2,李玉霞2，郭红萍3

(1.信阳农林学院茶学系，信阳市茶产业基础研究重点实验室，河南 信阳 464000；

2. 光山县净居寺茶场，河南 信阳 464000；3. 光山县净居寺名胜管理区，河南 信阳 464000)

摘要：本研究从标准曲线相关系数、加标回收、精密度等方面对GB/T8314-2002和GB/T8314-2013进行比较。结果表明GB/T8314-2013比GB/T8314-2002相关系数要高、加标回收更准确，精密度两者相当，测得茶叶中氨基酸要低15%左右。

关键词：茶叶游离氨基酸；分光光度法；茚三酮比色法；标准曲线

茶叶作为一种饮用产品，其滋味和香气直接影响产品质量及产品价格，茶叶中氨基酸是形成茶叶鲜爽滋味的重要物质，同时也是参与香气的形成重要物质之一[1]，与茶叶品质显著正相关，所以其含量的测定准确与否显得尤为重要。

茶叶中氨基酸总量的测定国标一直采用茚三酮比色法，方法的原理是：氨基酸在pH8.0的条件下与茚三酮反应，形成紫色络合物，利用分光光度计在波长570nm测定其吸光度，氨基酸浓度与吸光度成正比[2-3]。该标准最早由中国农业科学院茶叶研究所牵头起草制定GB/T8314-1987，先后修订2次，即GB/T8314-2002、GB/T8314-2013，笔者主要针对GB/T8314-2002和GB/T8314-2013的差异从标准曲线相关系数、加标回收、精密度等方面进行分析比较，结果表明GB/T8314-2013比GB/T8314-2002相关系数要高、加标回收更准确，精密度两者相当，测得茶叶中氨基酸要低15%左右。

1材料与方法

1.1实验仪器

HH数显恒温水浴锅，FA2104型分析天平(感量0.0001g)，微型植物试样磨碎机，GF-2型鼓风电热恒温干燥箱，SHB-Ⅲ型循环水真空泵，752紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)等。

1.2实验茶样与试剂

茶样：信阳毛尖、信阳红由信阳农林学院茶叶研究所提供，铁观音从市场购买。

实验试剂：磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，水合茚三酮，氯化亚锡，蒸馏水，谷氨酸。

1.3两种标准曲线制作方法

国标GB/T8314-2002：分别吸取浓度为0.1mg/ml氨基酸标准液0.0ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml与一组25ml容量瓶中，各加水4ml、缓冲溶液0.5ml、和茚三酮溶液0.5ml，在沸水中加热15min，冷却后加水至25ml，放置10min后，用5mm比色杯，在570nm处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度(A)。

国标GB/T8314-2013：分别吸取1ml浓度梯度为0mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml氨基酸标准液与一组25ml容量瓶中，各加入茚三酮溶液0.5ml、和缓冲溶液0.5ml，在沸水中加热15min，冷却后加水至25ml，放置10min后，用5mm比色杯，在570nm处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度(A)。

1.4两种标准方法回收率[4]

称取信阳毛尖样品3g用450ml沸蒸馏水沸水浴45min过滤，并用蒸馏水冲洗数次，冷却后定容到500ml，吸取过滤液1.0ml于一组25ml容量瓶中，每个样品中加入100ug/ml谷氨酸母液1ml，在依次加入茚三酮溶液0.5ml、和缓冲溶液0.5ml，在沸水中加热15min，冷却后加水至25ml，放置10min后，用5mm比色杯，在570nm处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度(A)，5次平行实验，按两种标准对实验结果进行计算。

1.5两种标准测定样品氨基酸含量精密度实验[5]

称取茶叶样品3g用450ml沸蒸馏水沸水浴45min过滤，并用蒸馏水冲洗数次，冷却后定容到500ml，吸取过滤液1.0ml于一组25ml容量瓶中，依次加入茚三酮溶液0.5ml、和缓冲溶液0.5ml，在沸水中加热15min，冷却后加水至25ml，放置10min后，用5mm比色杯，在570nm处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度(A)，4次平行实验，按两种标准对实验结果进行计算。

1.6结果计算

1.6.1样品中氨基酸含量的计算

式中：C——根据样品吸光度“E”值在标准曲线上所查得每毫升被测液中含氨基酸的毫克数除以1000，即得克量；V——样品总体积的毫升数。V1——被测样毫升数。

1.6.2 回收率的计算

式中：C1——根据加入标准母液样品的吸光度“E”值在标准曲线上所查得的每毫升被测液中含氨基酸的毫克量；C——根据未加入标准母液样品吸光度“E”值在标准曲线上所查得的每毫升被测液中含氨基酸的毫克量。

2结果与分析

2.1标准曲线制作结果

新旧标准主要区别由1.3可见主要体现在以下两个方面：首先是标准液中氨基酸浓度与梯度都不一样，旧标准分别是0mg、0.1mg、0.15mg、0.2mg、0.25mg、0.3mg，新标准分别是0mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg，由此可见新标准比旧标准氨基酸浓度梯度更大；其次，旧标准在标准曲线制作时，加入4ml的水，而新标准不加水，与样品处理一致更合理。

表1　两种标准曲线结果一览表

按1.3 标准曲线制作方法进行标准曲线制作，实验结果如表1，相关系数R2表示氨基酸的浓度与吸光度之间的线性关系，R2越接近1表明两者相关性越高；通常R2大于0.90时，认为两个变量有很强的线性相关性。从实验结果得出R2均大于0.90，即两种标准曲线制作方法氨基酸的浓度与吸光度两个变量之间都有很强的线性相关性。且相关系数R2新标准>旧标准。但由标准曲线方程可见，对同一样品，即同一吸光度，测得的氨基酸含量不同，而且相差较大，使氨基酸含量结果不可靠。

2.2两种标准回收率实验

表2　两种标准曲线回收率计算

按1.4对两种标准进行回收率实验，实验结果如表2，回收率指在样品中加入已知浓度体积的标样之后，测出的总含量减去原样品中的含量除以已知标样的含量就是回收率，回收率主要反应该方法的准确性，回收率越接近1，实验越准确，该实验中不同标准曲线计算得到的回收率不同[4]，GB/T8314-2002计算氨基酸加标回收率是1.17，与实际相差甚远，说明按GB/T8314-2002所测得氨基酸比实际高，相比之下GB/T8314-2013氨基酸加标回收率是1.004，GB/T8314-2002所测得氨基酸与实际氨基酸含量相当，新标准比旧标准更合理。

2.3两种标准测定样品精密度

表3　精密度分析结果

按1.5 方法精密度实验，实验结果如表3，精密度是指多次重复测定同一样品时各测定值之间彼此相符合的程度，表征测定过程中随机误差的大小。同时表示测量的再现性，是保证准确度的先决条件，但是高的精密度不一定能保证高的准确度。好的精密度是保证获得良好准确度的先决条件，一般说来，测量精密度不好，就不可能有良好的准确度。反之，测量精密度好，准确度不一定好，这种情况表明测定中随机误差小，一般相对标准偏差(%)在0～5之间，表示该处理样品的方法随机误差小，可以给保证获得良好准确度的结果提供了先决条件[6]，由实验结果可见，两种标准测定样品氨基酸平行实验RSD(%)均较低，即精密度均较高，由此可见，两种标准测定样品氨基酸含量精密度均较高。

3结论

茶叶中氨基酸含量的测定主要有自动分析仪法、高效液相色谱法、毛细管电泳法以及茚三酮比色法等方法，其中前三种方法重现性好，仪器稳定，结果可靠，但前处理复杂，成本高，所以目前茶叶中氨基酸测定国标法仍然采用茚三酮比色法。刘晓霞、周国兰[7]等人对GB/T8314-2002测定方法进行了探讨，黄本芬、吕小艇[8]等人对GB/T8314-2002中存在的问题提出了自己的观点，笔者主要针对新旧标准的差异即新标准中在标准曲线的制作是与样品处理一致，反应体系一开始没有加4ml水，而旧标准在标准曲线制作时反应体系加入4ml水，从标准曲线相关系数、加标回收、精密度等方面进行分析比较，结果表明GB/T8314-2013比GB/T8314-2002相关系数要高、加标回收更准确，精密度两者相当，测得茶叶中氨基酸要低15%左右。

参考文献：

[1]宛晓春,黄继轸,龚正礼.茶叶生物化学[M].3版.北京:中国农业出版社,2003.

[2]全国标准化技术委员会. GB 8314-2002茶 游离氨基酸总量测定[S].北京：中国标准出版社，2002．

[3]全国标准化技术委员会. GB 8314-2013茶 游离氨基酸总量测定[S].北京：中国标准出版社，2013．

[4]吴树宏,周春华.加标回收率的计算方法的探讨[J].甘肃环境研究与监测.2000,13(3):179-183.

[5]盖钧益.试验统计方法[M].北京:中国农业出版社,1985：44-46.

[6]南京大学编写组.无机及分析化学 [M].3版.北京：高等教育出版社，1996:262-265．

[7]刘晓霞，周国兰，何萍，等. 茶叶中游离氨基酸及其总量的国标法测定探讨[J].贵州茶叶，2008,1(133):13-17.

[8]黄本芬，吕小艇，何正秀. 改进茶叶中游离氨基酸总量测定方法[J].食品与发酵科技，2012,2(48):94-96.

(编辑：严佩峰)

Comparative Study of Determination of Amino Acid Content in Tea by Two Different Methods

CHEN Yi1, ZHANG Xiu-qing2，LI Yu-xia2, GUO Hong-ping3

(1.Tea Department of Xinyang College of Agriculture and Forestry, Key Laboratory of Basic Research in Xinyang Tea Industry,Xinyang 464000, China； 2. Tea Plantation of Jingju Temple in Guangshan County, Xinyang 464000, China；3. Scenic Spots Management Area of Jingju Temple in Guangshan County, Xinyang 464000, China)

Abstract：In this study, the GB/T8314-2002 and GB/T8314-2013 were compared in terms of standard curve correlation coefficient, adding standard recovery and precision of method. The results showed that the correlation coefficient of GB/T8314-2013 was higher than that of GB/T8314-2002, at the same time the recovery and the precision of the former was more accurate, and the amino acid content in the same sample was lower 15% .

Keywords：dissociated amino acids in tea;Spectrophotometry;Ninhydrin colorimetry;standard curve

中图分类号：TS272.7

文献标识码：A

文章编号：2095-8978(2016)01-0093-03

作者简介：陈义(1980—)，男，安徽舒城人，讲师，硕士，主要研究茶叶化学与茶叶加工.

基金项目：2015年度河南省高等学校重点科研项目(15B210009).

收稿日期：2015-09-20