铜绿假单胞菌生物膜形成机制及中药对其调控作用研究进展

何莎莎 赵京霞 徐霄龙 郭玉红 刘清泉,4

(1 首都医科大学附属北京中医医院，北京，100010； 2 中医感染性疾病基础研究北京市重点实验室，北京，100010；3 北京市中医研究所，北京，100010； 4 北京中医医院顺义医院，北京，101300)



铜绿假单胞菌生物膜形成机制及中药对其调控作用研究进展

何莎莎1,2,3赵京霞1,2,3徐霄龙1,2,3郭玉红1,2,4刘清泉1,2,3,4

(1 首都医科大学附属北京中医医院，北京，100010； 2 中医感染性疾病基础研究北京市重点实验室，北京，100010；3 北京市中医研究所，北京，100010； 4 北京中医医院顺义医院，北京，101300)

铜绿假单胞菌是一种能引起机体急性或慢性感染的条件致病菌，极易形成生物膜是其产生耐药的一个重要因素。近年来研究表明，中药对铜绿假单胞菌生物膜形成具有明显的抑制作用。作者就铜绿假单胞菌生物膜形成周期、生物膜形成的主要调控信号系统以及中药对生物膜形成的影响进行综述。

铜绿假单胞菌；生物膜；中药

铜绿假单胞菌是医院获得性感染的重要致病菌，能引起各种不同的急性或慢性感染。目前，临床上对铜绿假单胞菌感染的治疗不太理想，主要原因是该菌具有多重耐药性。铜绿假单胞菌的耐药机制比较复杂，主要包括有以下途径[1]：1)细胞膜通透性降低；2)主动外排泵；3)钝化酶产生；4)染色体突变和质粒转导获得耐药基因；5)形成生物膜。其中形成生物膜是铜绿假单胞菌耐药的一个非常重要的途径。与浮游细菌相比，生物膜中的细菌能够耐受抗生素和宿主的免疫反应，具有极强的耐药性。因此，研究铜绿假单胞菌生物膜形成的调控机制和研发抗生物膜形成药物十分重要。我国中药资源十分丰富，中医药在治疗耐药细菌感染方面具有独特优势，在临床上也常用中药联合抗生素治疗难治性铜绿假单胞菌感染性疾病[2]。我们对铜绿假单胞菌生物膜形成机制及中药对其调控作用的相关研究进行综述，为运用中药治疗铜绿假单胞菌感染疾病提供参考。

1 铜绿假单胞菌生物膜形成周期

细菌生物膜是指细菌黏附于接触表面，被自身分泌的胞外聚合物(EPS)包裹形成的细菌聚集的膜状结构[3]。与浮游细菌相比，生物膜形成时病原菌的抗药性比在游离状态下高50～5 000倍[1]。细菌生物膜形成是一个动态过程，主要由细菌和细菌自身分泌的胞外聚合物(EPS)组成，其中EPS占细菌生物膜总体积的85%[4-5]。EPS主要由胞外多糖、胞外DNA、多肽、脂类等组成，为细菌生物膜形成提供稳定性支架，并形成凝聚力调节细菌黏附至接触表面[6]。由于铜绿假单胞菌极易形成生物膜，已成为研究细菌生物膜的模式菌株。

胞外多糖是EPS的主要组成部分，铜绿假单胞菌至少产生3种不同的胞外多糖：alginate，Pel和Psl，它们决定了生物膜结构的稳定性[7]。黏液型和非黏液型铜绿假单胞菌合成的胞外多糖种类不同，其中黏液型铜绿假单胞菌主要合成alginate，而非黏液型主要合成Pel和Psl[8-9]。Alginate是由D-甘露糖醛酸和L-古罗糖醛酸组成的无支链聚合物[10]，主要维持细菌生物膜结构的稳定和所需的水分及营养物质[11]。Pel是一种葡萄糖含量丰富的多糖，其结构尚未确定[12]。Psl是由五糖重复单元组成，包括D-甘露糖、L-鼠李糖和D-葡萄糖[13]。Pel和Psl为生物膜发育提供主要的骨架结构，并且参与生物膜形成的早期阶段[14]。

铜绿假单胞菌的不同菌株或者在不同的营养条件下，会出现不同的生物膜结构[15]。在葡萄糖培养基中，铜绿假单胞菌PAO1生物膜形成周期主要分为以下5个步骤[16]：1)“可逆”的浮游细菌吸附在适合生长的接触表面；2)“可逆”的浮游细菌变成“不可逆”，更稳定的吸附在接触表面；3)“不可逆”的浮游细菌在EPS基质包裹下形成微菌落；4)生物膜的成熟和大菌落的形成；5)生物膜释放浮游细菌扩散吸附至其他接触表面。由此可见，细菌生物膜的形成是一个连续的循环过程。

2 铜绿假单胞菌生物膜形成的调控机制

生物膜不是细菌随意堆积形成的，而是具有相互协调作用的高度分化结构的群体。从浮游菌到细菌生物膜的形成，涉及到多种信号传导通路。生物膜内细菌通过菌间信号传导调节细菌内的不同基因表达，相互协调来维持生物膜的空间结构和功能。参与铜绿假单胞菌生物膜形成的调控信号转导系统主要有：群体感应系统(Quorum Sensing，QS)、双组分调节系统(Two-component Regulatory Systems，TCS)及第二信使c-di-GMP系统[17-19]。

2.1 群体感应系统与生物膜的形成 群体感应系统是细菌密度依赖调控系统，主要是通过感知扩散的化学分子信号，引起细菌一些特定基因的表达，从而调控细菌毒力因子的产生、细菌运动性和生物膜的形成[20-21]。铜绿假单胞菌根据信号受体蛋白不同将QS分为2类：一类是高丝氨酸内酯(Acyl Homoserine Lactone，AHL)-依赖的细胞间信号系统：Las系统和Rhl系统；和一个非AHL-依赖的细胞间信号分子-喹诺酮信号(PQS)系统。其中Las和Rhl系统分别由信号分子合成酶(LasI/RhlI)和转录因子(LasR/RhlR)组成。LasI和RhlI分别指导3-氧代十二烷基-L-高丝氨酸内酯(3-oxo-C12-HSL)和N-丁酰基-高丝氨酸内酯(C4-HSL)的合成，然后与各自的转录激活受体蛋白LasR/RhlR结合形成转录复合物，逐级调控下游基因的表达[22]。

QS系统在铜绿假单胞菌生物膜形成周期中发挥重要作用。Davies等在1998年研究发现，铜绿假单胞菌LasI突变组生物膜明显变平、出现未分化和容易从接触表面脱离的现象，表明Las系统在铜绿假单胞菌生物膜的形成和成熟中发挥重要作用[23]。Gilbert等报道QS系统转录因子LasR可以结合到Psl操纵子的启动子区域，调节胞外多糖Psl的表达[24]。Sakuragi等研究发现，Rhl系统通过增强Pel多糖的合成调节铜绿假单胞菌生物膜的形成。PQS系统与铜绿假单胞菌生物膜形成过程中的胞外DNA释放相关，lasI、rhlI、pqsA和fliMpilA突变菌株生物膜中胞外DNA含量比野生型菌株明显减少，并且突变菌株生物膜相对于野生型对十二烷基硫酸钠更敏感[25]。

2.2 双组分调控系统与生物膜形成 双组分调控系统可感应外界环境(pH、渗透压、温度、营养等)变化，并作出适应性调整以更好的适应环境。铜绿假单胞菌的基因组编码了129个TCS蛋白，GacS/GacA双组份调控系统是目前研究最透彻的TCS[26]，近年来与急性和慢性感染相关的RetS和LadS传感激酶也成为研究热点[27]。

GacS/GacA双组分系统是QS系统的上游调控系统，调控多种毒力因子的合成和生物膜的形成。GacS/GacA双组分调控系统通常是由跨膜蛋白传感器GacS和应答调控因子GacA组成。GacS感受外界传递的信号分子，与GacS配体结合部位结合，激活GacS，使其自身磷酸化，然后将磷酸基团传递给GacA，从而上调小RNA(RsmZ和RsmY)的表达，RsmZ和RsmY可以捕获小RNA结合调节蛋白RsmA，抑制psl基因(pslA-L)的转录后调控[28-30]。GacS/GacA系统还能通过抑制RsmA的活性负调控C4-HSL和3-OXO-C12-HSL的合成，从而控制Las系统和Rhl系统。

近年来研究表明，GacS/GacA双组分调控系统受到具有相反活性的RetS和LadS激酶的影响。RetS和LadS通过调节GacS磷酸化水平抑制或促进GacA的磷酸化，从而调控GacS/GacA系统功能[31-32]。组氨酸激酶Rets可以抑制生物膜的形成，而组氨酸激酶Lads可以抵消Rets的抑制作用。Goodman等研究表明，Rets突变株相对于野生型PAO1更容易产生生物膜，在急性和慢性感染中发挥重要作用[33]。Mikkelsen等研究发现，先天性Lads基因缺失的PA14菌株相对于PA14 LadS+菌株，生物膜的形成和III型分泌系统(T3SS)的表达都受到抑制[34]。

2.3 c-di-GMP调控生物膜形成 3′-5′环二鸟苷酸(bis-(3′-5′)-cyclic dimeric guanosine monophosphate，c-di-GMP)是广泛存在于细菌内的第二信使，是细菌生存和代谢过程中的关键调节因子，主要参与调节细菌生物膜的形成、细菌运动能力和细菌毒力[35]。细胞内合成的c-di-GMP要发挥调控作用，必须与受体相结合，通过改变受体蛋白的构象来调控不同的信号通路。

Alg44蛋白与胞外多糖alginate的合成相关，c-di-GMP能够结合到受体蛋白Alg44的PilZ结构域上，通过蛋白之间相互作用激活其他蛋白的活性，进而调节alginate的合成和生物膜的形成[36]。同时，转录调节因子也能结合到第二信使上调节基因的转录过程。FLeQ是第一个被发现的可以调节基因转录的c-di-GMP受体，通过与c-di-GMP结合调控铜绿假单胞菌中pel基因的转录，进而调控胞外多糖Pel的合成和生物膜的形成[37]。高浓度的c-di-GMP能够促进胞外多糖(alginate、Pel)的合成和细菌生物膜的形成[38]。而低浓度的c-di-GMP能够促进细菌运动性，抑制细菌生物膜的形成[39]。

3 中药及其有效成分对铜绿假单胞菌生物膜的影响

3.1 金银花及其有效成分 金银花为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花，具有清热解毒、疏散风热的功效。覃雪军等研究发现，金银花水煎液能明显抑制铜绿假单胞菌生物膜形成，并能抑制铜绿假单胞菌对固体表面的黏附能力，其抑制效果与红霉素相当；并且金银花水煎液在体外能增强头孢他啶对早期及成熟生物膜内铜绿假单胞菌的杀菌能力，这种协同效果在成熟生物膜内比红霉素更明显[40]。袁秀丽等研究发现，金银花水煎液125 g/L与庆大霉素1∶1联合用药对铜绿假单胞菌生物膜形成有明显抑制作用[41]。

绿原酸是金银花的主要抗菌有效成分。陈一强等研究发现，体外750 μg/mL浓度的绿原酸可抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成和延缓生物膜的成熟；大鼠腹腔注射40 mg/(kg·d)绿原酸连续3 d和7 d能够抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成，且QS系统在大鼠体内铜绿假单胞菌生物膜形成中起重要作用[42]。吴海英等研究发现，体外512 μg/mL浓度的绿原酸能够显著抑制黏液性铜绿假单胞菌生物膜的形成，绿原酸和左氧氟沙星联合用药可增强左氧氟沙星对生物膜内黏液性铜绿假单胞菌的抗菌性[43]。

3.2 鱼腥草及其有效成分 鱼腥草为三白草科植物蕺菜干燥地上部分，具有清热解毒、利尿消肿的功效。程惠娟等研究表明，鱼腥草水提液对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度为250 g/L，与阿奇霉素联合用药具有明显的抗菌增强作用，并能抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成[44]。

鱼腥草素钠是鱼腥草的主要有效成分，也是临床常用药物鱼腥草注射液的主要成分。王艳等研究发现，鱼腥草素钠对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度是300 μg/mL，抑制铜绿假单胞菌生物膜50%的浓度(SMIC50)在9.37～37.5 μg/mL，SMIC80在37.5～150 μg/mL之间[45]。朱玲玲等研究表明，头孢他啶抑制铜绿假单胞菌生物被膜SMIC50、早期、成熟期形成的用药浓度分别是16 μg/mL、16 μg/mL、32 μg/mL；而鱼腥草素钠与头孢他啶联合用药时，其对铜绿假单胞菌SMIC50、早期、成熟期生物膜形成的抑制浓度都下降至原来的一半，说明鱼腥草素钠与头孢他啶具有协同抗菌作用[46]。另有研究发现，鱼腥草素钠和左氧氟沙星对铜绿假单胞菌的MIC分别为128 μg/mL和0.25 μg/mL；1/2 MIC鱼腥草素钠和2 MIC左氧氟沙星联合用药能够抑制70%的生物膜形成，并且最高降低了92%的alginate浓度，扫描电镜观察到联合用药组更多的死亡细胞和清除的EPS，说明鱼腥草素钠与左氧氟沙星联合用药可能成为对抗铜绿假单胞菌生物被膜感染的有效抗菌剂[47]。

3.3 黄连及其有效成分 黄连为毛茛科黄连属多年生草本植物，有清热燥湿，泻火解毒之功效。王平等研究发现，黄连在12.5 mg/mL和6.25 mg/mL浓度下对铜绿假单胞菌分泌有显著的抑制作用，在25 mg/mL和6.25 mg/mL浓度下对生物膜形成有显著的抑制，并且能显著抑制各组弹性蛋白酶表达，提示黄连可能是铜绿假单胞菌群体感应系统的抑制剂[48]。进一步研究发现，黄连乙酸乙酯提取物和氯仿提取物在3.12 mg/mL浓度时，对铜绿假单胞菌增殖、绿脓菌素分泌、弹性蛋白酶分泌、生物膜形成能力都有明显的抑制作用，并且在12.5 mg/mL浓度时能够明显上调QS系统中lasR和rhlR的转录水平，抑制lasB转录水平[49]。

黄连素又称小檗碱，是黄连的主要生物碱活性成分。研究发现黄连素不仅具有抗菌作用，而且在治疗腹泻、心血管疾病、抗肿瘤、糖尿病等多方面具有药理作用[50]。贾子中等研究发现，黄连素对铜绿假单胞菌生物膜形成的MIC为8 692 μg/mL，2 MIC对细菌生物膜有抑制作用，说明黄连素是一种有效延缓铜绿假单胞菌生物膜形成的生物碱[51]。

3.4 黄芩及其有效成分 黄芩为唇形科黄芩属多年生草本，以根入药，有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效。研究表明，黄芩及其有效成分有显著的体内外抗菌作用，对治疗日渐增加的耐药细菌感染意义重大[52]。田芳等研究表明，黄芩水煎液对铜绿假单胞菌生物膜形成有明显的抑制作用，其生物膜最低抑菌浓度为31.25 mg/mL，黄芩水煎液在浓度高于3.93 mg/mL时与硫酸庆大霉素联用具有协同抑菌作用[53]。

黄芩的抗菌有效成分为黄酮类化合物，主要包括黄芩苷、黄芩素等。谢林利等研究发现，32 μg/mL的黄芩苷和2 μg/mL的黄芩素能够明显抑制铜绿假单胞菌的黏附性和生物被膜的形成[54]。菅凌燕等研究显示，黄芩苷浓度大于5 mg/mL时，铜绿假单胞菌生物膜内活菌数显著减少，黄芩苷与左氧氟沙星联用可显著增强其抗菌活性，降低细菌耐药[55]。王贵年等研究发现，16.65 mg/mL黄芩苷对体外铜绿假单胞菌生物膜有较强的抑制作用[56]。另有研究表明，黄芩苷分别与头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦联合用药时，都能显著增强其对铜绿假单胞菌生物膜的清除能力[57-58]。

4 结语

铜绿假单胞菌生物膜的形成能够有效地抵御抗生素和机体免疫系统攻击，并易产生多重耐药，给临床上治疗铜绿假单胞菌感染性疾病带来很大困难。因此，研究铜绿假单胞菌生物膜形成的调控机制和研发抗生物膜药物十分必要。目前国内外对调控绿假单胞菌生物膜形成的分子机制研究比较深入，主要包括群体感应系统、双组分调节系统及第二信使c-di-GMP系统。大量研究表明，中药在抗细菌生物膜形成方面具有独特优势，其中金银花、鱼腥草、黄连、黄芩等中药及其有效成分对铜绿假单胞菌生物膜形成具有明显的抑制作用，但其主要在体外试验进行研究，缺乏对抗生物膜形成的机制研究。因此今后应在体外试验基础上加强中药及其有效成分对生物膜形成的机制研究，特别是药物如何调控群体感应系统、双组分调节系统及第二信使c-di-GMP系统等研究，为临床治疗耐药铜绿假单胞菌感染提供理论依据。

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[58]董必英，陈一强，孔晋亮，等.黄芩苷联合头孢哌酮/舒巴坦对铜绿假单胞菌生物膜破坏作用的体外研究[J].中国现代医药杂志，2016,18(1):1-4.

(2016-09-12收稿 责任编辑：洪志强)

Research Progress of Pseudomonas Aeruginosa Biological Film Formation Mechanism and Its Chinese Material Medica Regulations

He Shasha1,2,3, Zhao Jingxia1,2,3, Xu Xiaolong1,2,3, Guo Yuhong1,2,4,Liu Qingquan1,2,3,4

(1BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicine,AffiliatedwithCapitalMedicalUniversity,Beijing100010,China;2BeijingInstituteofTraditionalChineseMedicine,Beijing100010,China; 3BeijingKeyLaboratoryofBasicResearchwithTraditionalChineseMedicineonInfectiousDiseases,Beijing100010,China;4BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicineShunyiBranch,Beijing101300,China)

Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogenic bacterium that causes acute or chronic infection, one of its drug resistance factor is to form biological film easily. According to recent studies, Chinese material medica has significant inhibitory effect on pseudomonas aeruginosa biological film formation. The author reviewed the biological film formation cycle of pseudomonas aeruginosa, the major regulatory signal system for biofilm formation and the impact of Chinese material medica on it.

Pseudomonas aeruginosa; Biological film; Chinese material medica

北京市医院管理局重点医学专业发展计划专项(编号：ZYLX201611)；国家科技重大专项课题(编号：2013ZX09102026)

R378.99+1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.10.003