铜绿假单胞菌耐药机制及中医药治疗研究进展

丁雪霏 丁军颖 赵京霞, 郭玉红，3,4 刘清泉,,4

(1 首都医科大学附属北京中医医院,北京，100010； 2 北京市中医研究所，北京，100010； 3 中医感染性疾病基础研究北京市重点实验室，北京，100010； 4 北京中医医院顺义医院，北京，101300)



铜绿假单胞菌耐药机制及中医药治疗研究进展

丁雪霏1丁军颖2,3赵京霞1,2,3郭玉红1，3,4刘清泉1,2,3,4

(1 首都医科大学附属北京中医医院,北京，100010； 2 北京市中医研究所，北京，100010； 3 中医感染性疾病基础研究北京市重点实验室，北京，100010； 4 北京中医医院顺义医院，北京，101300)

随着抗生素的不规范使用，近年细菌耐药率越来越高。临床尤以感染性疾病的多见病原菌——铜绿假单胞菌最为突出，不仅是临床急危重症的棘手问题，也是国际医学界的难题和焦点。为此，作者综述了近5年来铜绿假单胞菌耐药机制研究进展，并对β-内酰胺酶、主动外排系统、密度感应系统等主要耐药机制着力阐述，进而阐释相关的中医药治疗措施，以期为抗生素治疗无果时探索中医药治疗思路提供依据。

铜绿假单胞菌；β-内酰胺酶；主动外排系统；密度感应系统；中医药

铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa，PA)属假单胞菌属，革兰氏阴性杆菌，是医院感染的主要条件致病菌，能引起各种感染性疾病，是临床常见致病菌。2014年CHINET细菌耐药监测数据显示，该菌在临床感染致病菌的检出率居第四位。近年，由于抗菌药物的不规范使用，其耐药率逐年递增，多药耐药数量和耐药率也逐年攀升，成为临床治疗的难题，尤其为急危重症的治疗带来了极大困扰。PA已逐渐成为院内感染多重耐药的代表性革兰氏阴性菌，耐药机制尤其复杂。

1 铜绿假单胞菌耐药机制

1.1 获得性耐药 PA能够通过整合子、转座子等可移动遗传单位获得外源耐药基因，并整合到自己的染色体中进行转录，从而获得耐药。整合子在整合酶催化作用下将游离耐药基因盒整合到59 bp特异性识别位点上，特异性整合的耐药基因盒可被自由整合或切除，非特异性整合则不可。国内外多项研究表明，Ⅰ类整合子最常见，Ⅱ、Ⅲ类整合子比较少见。Ⅰ类整合子中研究最多的为磺胺类耐药基因dfrAs，是最常见的基因盒，其次为氨基糖苷类耐药基因aadA，β-内酰胺类耐药基因等其他基因盒检出率很低[1-2]。同时，Ⅰ类整合子的3个开放阅读框中溴乙锭耐药基因(qacE△l)与磺胺耐药基因(sull)检出率很高，可作为Ⅰ类整合子的标志基因[3]。整合子能够在同类生物中水平转移，且自然转换可以促进其在不同物种之间转移[4]，加之人类不断发现新的基因盒，表明整合子可以通过其基因的灵活性和多样性适应环境，广泛传播，成为多重耐药菌迅速发展的重要原因。

1.2 固有耐药 PA通过灭活酶、膜通透性下降、主动外排系统过度表达、药物作用的靶位改变、产生生物膜及密度感应系统等机制对抗菌药物产生耐药。

1.2.1 产生灭活酶 PA可产生β-内酰胺酶、氨基糖苷类修饰酶、氯霉素乙酰转移酶等，其中β-内酰胺酶可使β-内酰胺类抗生素分子开环失活，是其主要的耐药机制。β-内酰胺酶主要包括C类头孢菌素酶(AmpC)、超广谱β-内酰胺酶(estend-spectrumβ-lactamases，ESBLs)和金属酶(metallo-β-lactamase，MBL)等。

1.2.1.1 β-内酰胺酶 1)ESBLs：ESBLs是一类由质粒介导的，能水解头孢菌素类、青霉素类及单环类抗菌药物，但对头霉烯类、碳青霉烯类抗菌药物及酶抑制剂敏感的β-内酰胺酶。ESBLs有2种分类方法，Ambler等人根据氨基酸序列的差别将其分为A、B、C、D四类，随后Bush等人根据功能将其分为4个群，大多数ESBLs属于前者的Ambler A类，后者的2be群，少数属于前者Ambler D类，功能群的Bush-d类[5]。A类ESBLs可分为TEM、SHV、PER、VEB、GES、IBC型，虽底物谱相似，但其基因却多半不同源，呈现出明显的地域差异。属于D类的OXA型ESBLs有3个基因来源，对不同抗菌药物水解活性各有差异，且自报道以来，仅国内就至少有127个成员[6]。

ESBLs由质粒介导，其编码基因大多位于质粒上，细菌可通过多种方式使ESBLs基因在细菌间水平转移和传播，还可将这些耐药基因进行整合、重组，甚至可以将其整合到染色体上垂直传播，形成多重耐药，是铜绿假单胞菌耐药性日趋严重的重要原因[7]。

2)AmpC酶：AmpC酶是一种不被克拉维酸抑制的丝氨酸头孢菌素酶，水解底物首选头孢菌素，分为染色体编码和质粒编码2种。染色体编码的AmpC有可诱导性，即正常状态下为低水平表达，在有诱导作用的β-内酰胺类抗生素存在时，产酶量会显著上升。人们还在不断地探索诱导AmpC产酶的因素，如一项国外研究发现，在编码ApmC的染色体中插入ISAbal元件，此基因会提供高效启动子blaAmpC基因，使其成为超表达AmpC酶[8]；另一项国内研究发现，密度感应系统QS中的las QS系统可能直接或间接影响AmpC的基因诱导表达[9]；此外，一些DNA结合蛋白如AmpR、AmpD可转化为AmpC活化因子从而调节AmpC的表达。质粒编码的AmpC酶自上世纪80年代被分离出以来，世界各地不断发现MIR、ACT、DHA、CMY、FOX、MOX等新型质粒AmpC酶，且分布存在地区差异。MaiM.Helmy和Reham Wasfi用PCR扩增方法研究发现，CMY型为主要的AmpC酶，占143例孤立细菌的86.9%，其次为DHA、FOX、EBC、MOX[10]。质粒编码的AmpC酶有更广的水解底物，不水解碳青霉烯类抗菌药物，多恒定表达，不受诱导[11]。

3)MBL：近年来，随着碳青霉烯类抗菌药物的广泛应用，PA金属β-内酰胺酶的耐药性显著上升。MBL依赖金属锌离子而发生催化活性，能够水解除单环类几乎所有的β-内酰胺酶类抗菌药物，其编码基因广泛存在于染色体及质粒、转座子、整合子等移动元件中，大部分通过可移动原件在细菌间水平传播，少部分为垂直传播，为临床治疗带来极大的困难。目前已发现几种MBL类型，包括IMP、VIM、SPM、GIM和SIM等，又包括若干亚型，其中IMP、VIM对临床影响最大，二者均大部分位于整合子Ⅰ中，在细菌中水平传播。IMP、VIM的分布存在地区差异，来自伊朗的一项研究表明，75%产MBL酶的铜绿假单胞菌均携带IMP基因，VIM型包括VIM-1、4、5、7、8、9等，其中VIM-1型则较VIM2型更为常见[12]，VIM-7可水解亚胺培南及青霉素；国内研究也表明IMP型所占比例最大，其IMP-1基因占24.21%，其他类型较为少见[13]。Tada等研究表明基因突变是IMP型铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗菌药物产生耐药的重要原因[14]。

1.2.1.2 氨基糖苷类修饰酶 PA对氨基糖苷类抗菌药物耐药的原因包括产氨基糖苷类修饰酶、细菌16S rRNA基因甲基化酶和氨基糖苷类抗菌药物作用靶位16S rRNA基因突变等，其中产AME为主要原因。16S rRNA基因甲基化酶可保护自身30S核糖体不与氨基糖苷类抗菌药物结合，造成PA对所有氨基糖苷类药物高度耐药。氨基糖苷类修饰酶按功能可分为乙酰转移酶(AAC)、磷酸转移酶(APH)、核苷转移酶(ANT)3类[15]，可对进入菌内的氨基糖苷类抗菌药物进行修饰，使其失活。编码AME的耐药基因位于质粒及转座子、整合子等移动元件中，常见的基因型有aac(3′)-Ⅱ、aac(6′)-Ⅰ、aac(6′)-Ⅱ、ant(2′′)-Ⅰ、ant(3′′)-Ⅰ、aph(3′)-Ⅵ等，其中aac(6′)-Ⅰ介导对妥布霉素和阿米卡星耐药，aac(6′)-Ⅱ和ant(2′′)-Ⅰ对妥布霉素和庆大霉素耐药，aph(3′)-Ⅵ对阿米卡星耐药[16]。一项研究表明ant(2′′)-Ⅰ和aac(3′)-Ⅱa为最常见的基因型，分别占78.87%、47.88%，同时展示了不同基因与表型之间的关系[17]，这与国内研究并不相符[18]，说明耐药基因存在地区差异，可能与使用抗菌药物种类有关，需要我们有针对性的研究，为临床合理选择抗菌药物提供支持。

1.2.2 膜通透性下降 PA细胞膜上有特异性孔蛋白，可作为渗透性小或渗透不完全的分子进入细菌体内的通道，当膜孔蛋白丢失或表达下降时，抗菌药物则不能进入菌内，导致耐药。膜特异性孔蛋白包括OprC、OprD、OprE、OprF、OprG和OprH[19]，OprD的高突变型和调节性使其成为PA耐碳青霉烯类抗菌药物的最基本机制，其中OprD2的缺失或突变作为耐亚胺培南(IPM)的重要机制得到了国内外学者的广泛重视。OprD2为亚胺培南的唯一特异性通道，可发生多点突变、缺失突变、插入突变，其中最常见的缺失、突变有2种：一种为编码区395-405位11 bp DNA片段小缺失，引起移码突变，导致复制提前终止；另一种为启动子上游-519位到编码区685位的1204 bp DNA片段的大缺失，不能转录mRNA，导致OprD2蛋白缺失，形成耐药[20]。丁军颖等通过实验研究检测北京中医医院2014年铜绿假单胞菌对20种抗生素的敏感性，发现有9株菌对20种抗生素均耐药，但OPRD2耐药基因表达率也并非100%[21]。OprD的表达水平除受MexT、CopR等基因调节，也受调控因子影响，如高水平的c-di-GMP通过减少OprD的量提高PA对抑菌浓度IPM的适应性，锌离子通过CzcRS双组份调节系统提高PA毒力等，其调控因子还有很多，值得我们进一步探索。

1.2.3 主动外排系统过度表达 PA细胞膜上的主动外排系统是一种质子泵，由3种蛋白构成：1)外膜通道蛋白，如OprM、OprJ、OprN等，位于细胞膜外，形成门通道，排出抗菌药物；2)内膜蛋白，如MexB、MexD、MexF、MexY，可识别药物并将其转运出菌体，但无特异性；3)膜融合蛋白或辅助蛋白，如MexA、MexC、MexE、MexX等，连接内外膜蛋白。3者共同作用将抗菌药物排出体外。现已发现4种主要的主动外排系统，包括MexAB-oprM、MexXY-oprM、MexCD-oprJ、MexEF-oprN，其中MexAB-oprM的研究最为深入，其次为MexXY-oprM。

MexAB-oprM是PA中发现的第一个RND型外排系统，在野生菌株中低表达，为固有耐药机制之一，其水解底物最广。MexAB-oprM由MexA、MexB、OprM 3种蛋白构成，均由同一操纵子mexO所编码，受多种调控基因调节，如mexR、nalC、nalD，编码阻遏蛋白mexR、nalC、nalD，当调控基因突变时，可使mexO失去抑制而增强表达，引起对β-内酰胺类、氟哇诺酮类抗菌药物、四环素类和β-酰胺酶抑制剂的耐药；其过表达也对美罗培南MIC影响明显，却几乎不影响IMP。研究发现，QS系统也可影响MexAB-oprM的表达，当细菌数量达到10-7个/mL时，便会激活QS系统，诱导、增强MexAB-oprM转录和表达[22]。MexXY由MexX和MexY 2种蛋白组成，均由MexXY操纵子编码，可借助OprM获得自身缺失的外膜蛋白，因此MexAB-oprM表达降低可影响MexXY的活性。MexXY-oprM的阻遏调控基因为mexZ，其突变可导致对氨基糖苷类、红霉素和氟喹诺酮类抗菌药物耐药[23-24]。MexAB-oprM还可抑制OprD的转录，影响PA对亚胺培南的耐药性。关于各主动外排系统之间的相互影响及与其他耐药机制的互相作用仍需进一步研究。

1.2.4 靶位改变 抗菌药物与细胞膜上特异性结合的靶位有青霉素结合蛋白(Penicillin-Binding-Proteins，PBP)、16 s核糖体RNA(16 sr RNA)和拓扑异构酶。PBP位于细胞内膜，参与合成细菌细胞壁肽聚糖，包括内肽酶、转肽酶和羧肽酶，β-内酰胺类抗菌药物可与之结合，干扰细胞壁生成，还可触发PA的自溶酶活性。PBP结构分为两部分：青霉素结合位点和非青霉素结合位点，PA主要通过PBP基因突变改变自身结构，使其与β-内酰胺类抗菌药物亲和力降低或消失而耐药。有国外研究显示，PBP还可以诱导AmpC酶高度表达[25]。截止到2013年在PA中已经发现了8中PBP，其中PBP2和PBP3与耐碳青霉烯类抗菌药物有关，实验发现IMP对PBP2有高度依赖性，推测PBP2为IPM的作用靶点[26]。

1.2.5 生物膜 生物膜在PA耐药机制中起到了重要作用，但其作用机制尚不完全清楚，目前主要有3种推论：渗透限制、营养限制和表型[27]。

渗透限制学说认为，生物被膜阻止了抗生素渗入，是有生物膜的PA耐药的主要机制。生物膜外的基质屏障作用曾被认为是主要的耐药机制：基质带有大量阴离子，可吸附阳离子抗菌药物；还带有酶，可灭活部分抗菌药物。当结合位点饱和或酶消耗殆尽时，抗菌药物仍能通过机制屏障，且生物膜对氟喹诺酮类抗生素表现为高通透性，而敏感性却远低于浮游菌，所以该机制并不能完全解释PA生物膜的耐药机制。

营养限制学说认为，表层PA容易获得养料氧气，代谢率高，抗菌药物多针对代谢活跃的细菌，因此表层细菌易被杀死；深层细菌因有基质包绕，不易获得营养，代谢率低，且代谢产物不易排出，造成周围环境偏酸，可使大部分抗菌药物失活，二者共同作用，使深层细菌极难清除，当环境适宜时，残留的深层细菌便会迅速繁殖。

表型推断学说从基因角度解释生物膜的耐药机制。PA生物膜形成可分为5个阶段，每个阶段都有不同的基因激活产生独特的表型，当影响抗菌药活性的基因被激活时，便会对细菌耐药性产生影响。例如细生物膜主要成分之一为藻酸盐，由algD编码合成，其基因突变可产生大量藻酸盐，导致生物膜耐药性大大增加，又能直接作用于宿主，抑制其免疫功能。该学说已成为生物膜耐药机制的主要研究方向。

1.2.6 密度感应系统 密度感应系统(Quorum Sensing System，QS)是通过细菌密度来调节细菌生命活动的细胞间信号传导系统，影响着PA外毒素、弹性蛋白酶、溶血素、生物膜、鼠李糖脂等多种致病因子的表达。PA中存在3个QS系统：受高丝氨酸(Acyl-homoserine Lactone，HSL)调控的Las、Rh1系统和喹诺酮信号系统(Pseudomonas Quinolone Signal，PQS)。Las系统激活LasI蛋白质转录，合成PA自诱导物3-氧代十二烷基-L-高丝氨酸内酯，与受体蛋白LasR结合启动下游基因表达。Rh1系统由Ph1I合成的自诱导物N-丁酰-L-高丝氨酸内酯和受体Rh1R构成。两系统虽有不同的调节因子，但LasR和Rh1R有大量的重叠，说明Las、Rh1系统并不完全独立。PQS系统以2-庚基-3-羟基-4-喹诺酮为信号分子，不依赖AHL，以分级调控的方式水平调控PA多种毒性因子的表达。3个系统之间也存在级联调控关系，干扰QS系统会明显降低PA的致病能力，探讨QS系统之间及与外界环境的相互调节关系，将是以后研究的重点[28-30]。

2 中医药对铜绿假单胞菌的认识及治疗

中医学对铜绿假单胞菌感染有独特的认识见解。早期普遍认为与伏邪相关。早在《黄帝内经》就提到一类与时气不合的疾病，这为后世伏邪学说奠定了基础。吴又可在《瘟疫论》中首次提出伏邪概念，吴鞠通在《温病条辨》中进一步详细阐述，至清代，各医家对伏气温病的认识已扩展到温病以外的外感疾病。历代医家不断完善伏邪学说，为现代中医药应用提供了丰富的理论支持。

伏邪治疗原则为扶正透邪。因此，在治疗耐药菌感染时，不仅重视益气养血扶正，更重要的是解毒清热透邪外出。喻嘉言在《医门法律·痢疾门》中指出——邪陷入里，虽百日之久，仍当引邪由里出表，若但从里去，不死不休。刘清泉教授的扶正透邪芪归银方同理而出，其运用中医理论和辨证分型思维模式，积多年临床实践——始终以扶正透邪治则治疗细菌性肺炎，据法遣方用药而形成，已证实临床疗效肯定[30]。

中医理论认为耐药菌感染的核心病机是正气不足、邪毒内伏，其临床表现为虚实夹杂，多以气血亏虚、气机不畅为本，以血瘀、痰凝、湿热夹杂为标，与伏邪致病特点相似。目前临床治疗此类疾病通常广泛应用寒凉的抗生素及清热解毒类中药制剂，较少顾及患者正气。马明坤等人用清热法对上呼吸道常见致病菌做了体外抑菌实验(163株致病菌中包括17株铜绿假单胞菌)，以清热合剂以银翘散为底方进行加减，实验表明清热合剂对除外肺炎克雷伯菌之外的上呼吸道常见致病菌均有一定抑菌作用，其中对铜绿假单胞菌抑制作用最强，但总体效果仍差强人意[31]。刘清泉教授则认为扶正与祛邪并重，提倡鼓动正气透邪外出。扶正透邪代表方剂芪归银，以黄芪配当归益气和营清热，既避免苦寒伤阳，又可透邪外出，二者配伍，为当归补血汤，气血双补，并可退虚热；当归和金银花配伍，取自四妙勇安汤，补血活血，祛邪外出；结合青蒿退虚热、除蒸热；虎杖清热化瘀，全方补而不腻，给邪以出路。临床应用显示，芪归银方可明显减低感染者的死亡率[32]。芪归银在体外对铜绿假单胞菌无直接抑菌作用；但可降低头孢他啶、头孢哌酮舒巴坦、亚胺培南西司他丁钠的MIC和MBC值，并对β-内酰胺酶水解具有明显抑制作用[33]，可使耐亚胺培南的PA的敏感性得到一定程度恢复，从而逆转其耐药性[34]；同时证实，可调节机体免疫平衡，使感染所致的免疫紊乱趋于平衡[35]，相关机制有待进一步研究揭示。

3 展望

铜绿假单胞菌耐药机制复杂，存在天然耐药和获得性耐药，且可二者并存，这极大地加重了临床治疗困难，所以进一步深入研究阐明其确切耐药机制，从而针对性发展治疗措施势在必行；同时，尤其在抗生素针对病原菌治疗困境难脱时，中医药以人为本的扶正透邪治疗理念也值得着力探索。

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(2016-09-12收稿 责任编辑：洪志强)

Research Progress on Resistance Mechanisms of Pseudomonas Aeruginosa and Treatment from Traditional Chinese Medicine

Ding Xuefei1, Ding Junying2,3, Zhao Jingxia1,2,3，Guo Yuhong1，3,4, Liu Qingquan1,2,3,4

(1BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicineAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity,Beijing，100010,China; 2BeijingResearchInstituteofTCM,Beijing，100010,China; 3BeijingKeyLaboratoryofBasicStudyonTCMInfectionDisease，Beijing，100010,China; 4BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicineShunyibranch,Beijing101300,China)

As the unreasonable application of antibiotics, the bacterial resistance rate is getting higher and higher, especially the pseudomonas aeruginosa, which was the main pathogenic bacteria in infectious diseases, and this was not only the difficult problem of clinical acute and severe diseases but also the trouble and focus internationally. Therefore, the resistant mechanism research progress of pseudomonas aeruginosa in the recent five years were reviewed. The main resistant mechanism of beta lactamase, active efflux system and quorum sensing system were focused on, and the relevant Traditional Chinese Medicine treatment were detailed, in order to provide a basis for exploring the Traditional Chinese Medicine treatment when antibiotic treatment has no efficacy.

Pseudomonas Aeruginosa; Beta Lactamase; Active Efflux System; Quorum Sensing System; Traditional Chinese Medicine

国家自然科学基金项目(编号：81373813；81503399)

R378.99+1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.10.004