潍坊地区鸡场禽腺病毒分离鉴定

吕新年　（山东省昌乐县畜牧兽医局　262400）

潍坊地区鸡场禽腺病毒分离鉴定

吕新年（山东省昌乐县畜牧兽医局262400）

2016年4月份，从山东潍坊一个肉鸡场送检一批病死鸡，笔者对该病死鸡进行临床剖检和分子生物学诊断。临床诊断发现该病鸡出现心包积液，肝脏肿大，有坏死点。初步诊断为腺病毒。取病死鸡肝脏研磨并接种鸡胚后，提取尿囊液DNA，使用腺病毒特异性引物扩增出片段，并在NCBI上比对与I群腺病毒IV型相似度最高。因此诊断为腺病毒感染引起。本报道确诊了腺病毒在该地区养殖场中流行情况，给该病毒的预防和治疗提供理论依据。

禽腺病毒(Fowl Adenovirus, FAV)根据群特异性抗原的不同分为三个群，I群禽腺病毒(Fowl Adenovirus Group I, FAVI)具有共同的群抗原，包括传统的禽腺病毒及其它禽类分离物，共12个血清型，代表株为鸡胚致死孤儿病毒(Chicken embryo-lethal orphan virus)[1]。该群病毒在鸡、鸭、鹅体内普遍存在，能使鸡群呈隐性感染，作为继发病原共同作用家禽，并能垂直传播，污染鸡胚，而我国现有的禽用生物制品大多是用非免疫鸡胚制备，因此该群病毒的潜在污染严重影响了胚源生物制品的质量[2]。最近，在山东地区发现一些鸡群感染发病，病鸡大群精神萎靡，有些鸡只呈现猝死，死亡鸡只剖检观察发现呈现明显心包积液，肝脏坏死等病变。最近许多有文献报道，在我国腺病毒流行且呈现类似症状[3,4]。对此鸡群进行针对性检测。现将结果报道如下。

1　材料和方法

1.1材料山东省潍坊市某鸡场送检病死鸡数只；SPF授精种蛋购自山东无特定病原种鸡场。Taq酶购自上海生物工程公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒为Qiagen 公司产品；其它试剂均为国产或进口分析纯试剂 。

1.2临床症状及剖检观察通过询问和到场观察鸡群情况，并剖检观察病死鸡临床症状。

1.3病毒分离及鉴定从病鸡肝脏研磨后，加生理盐水浸泡1ml，10000r/min，离心5min，取上清用0.2μm滤器过滤，采用绒毛尿囊膜途径接种9～10日龄SPF鸡胚，置35℃温箱孵育24h后观察，剔除死胚，继续孵育2d后收获尿囊液。按常规方法制备不同浓度(2%)的鸡红细胞和大鼠红细胞，检测尿囊液是否具有凝集这些红细胞的特性。并使用H9流感病毒和新城疫病毒特异性抗体进行血凝抑制试验。

1.4病毒基因组的提取按常规方法进行尿囊液病毒基因组的提取。

1.5PCR扩增根据GenBank中I群禽腺病毒代表株CELO病毒的全基因组序列，设计合成了如下1对引物：PL1：5′ggggcggccgcgatgatgtataataacct3′FL2：5′gggtctagactcacgcg acatgactgtct3′ 分别扩增I群禽腺病毒基因组左末端L片段。上述引物由大连宝生物工程公司合成。然后取0.1μg的病毒DNA进行PCR扩增，采用50μl的PCR体系：DNA 0.1μg，10×PCR buffer5μl，25mM MgCl23μl，10mM dNTP1μl，上游引物和下游引物各25pmol，Taq酶0.5U，加灭菌超纯水至50μl，经94℃5min变性，然后94℃1min，55℃1min，72℃2min，30个循环扩增，72℃10min延长，4℃保存。

1.6PCR产物的回收、连接及测序将PCR产物通过0.8%琼脂糖凝胶电泳，切下目的片段，并用琼脂凝顺收试剂盒回收纯化，并送上海生物工程公司测序 。

1.7序列比较将序列使用NCBI中的Nuclear acid blasting进行序列比对。

2　结果

2.1病鸡临床观察鸡群大群精神萎靡，食欲不振，病鸡在3天时开始死亡，死亡率达40%左右，病死鸡剖检观察发现明显心包积液，肝脏明显肿大，有坏死点。有的有继发大肠杆菌感染，出现包心包肝症状。

2.2病毒分离鉴定结果收集鸡胚尿囊液后，使用鸡和大鼠红细胞进行血凝反应发现，尿囊液血凝效价高达log25，然而H9流感病毒和新城疫病毒血凝抑制试验没有检测到抗原存在。分离到了腺病毒。

2.3分子生物学鉴定为了进一步验证该鸡群发病是由于腺病毒引起，将设计引物，扩增腺病毒基因，并通过测序后，将序列与NCBI数据库中的序列并比对发现，与I群腺病毒IV血清型病毒相似性最高，达到99.9%。

3　讨论

（1）根据本研究的结果，判定该鸡群感染I群血清IV型腺病毒，最近有文献报道在我国许多地区该病毒的感染都有报道，证明在潍坊地区，该病毒已经流行。在本病例报道中，发现该病毒感染性较强，传播性较强，一个鸡群发病后，该鸡群的其他鸡只也相应发病。在周边鸡场中也发现该病的流行，说明该病毒传播性较强。另外，感染该病后，死亡率高达40%。有的报道发现死亡率还高。主要引起心包积液和肝脏肿大及坏死点等临床病变，可以作为特征性症状进行初步诊断。（2）为了更准确的诊断，进行了病毒的分离与分子生物学鉴定。成功分离到含有血凝性的尿囊液，对尿囊液使用流感、新城疫等抗血清进行血凝抑制，发现并没有流感和新城疫的感染。为了进一步确定该尿囊液中含有腺病毒。设计腺病毒特异性引物扩增，PCR结果呈现阳性，将DNA回收后送测序，并将序列上传NCBI进行核酸序列比对发现与近期我国分离的I群血清IV型腺病毒相似性搞到99%以上[3,4]，进一步证明了判定的准确性。（3）针对该病毒已经在该地区流行，对于腺病毒的预防和控制迫在眉睫。现在市场上已经有针对该血清型的腺病毒疫苗，可以在使用疫苗防控的同时对已经感染发病毒的鸡场进行用药，一定程度减轻经济损失并预防该病毒的传播。然而，最重要的还是做好生物安全工作，只有做好生物安全，切断传播途径，才能更好的控制住病毒的暴发。

[1] 殷震. 动物病毒学[M]. 北京: 科学出版社; 1997.

[2] 周斌, 曹瑞兵, 芦银华, 陈德胜, 陈溥言. 随机引物PCR扩增鸡胚致死孤儿病毒DNA的研究[J]. 中国病毒学. 2003;18(2):137-40.

[3] Zhao J, Zhong Q, Zhao Y, Hu YX, Zhang GZ. Pathogenicity and Complete Genome Characterization of Fowl Adenoviruses Isolated from Chickens Associated with Inclusion Body Hepatitis and Hydropericardium Syndrome in China. PLoS One. 2015;10(7):e0133073.

[4] Niu YJ, Sun W, Zhang GH, Qu YJ, Wang PF, Sun HL, et al. Hydropericardium syndrome outbreak caused by fowl adenovirus serotype 4 in China in 2015. The Journal of general virology. 2016.

S858.31

B

1007-1733(2016)12-0040-02

（2016–08–31）