ELISA试验中常出现的问题及解决方法

吴召坤 巩雪英 刘粉红/陕西省丹凤县畜牧兽医中心

ELISA试验中常出现的问题及解决方法

吴召坤 巩雪英 刘粉红/陕西省丹凤县畜牧兽医中心

ELISA试验，即酶联免疫吸附试验，具有敏感性高的特点，兽医实验实常用ELISA试验检测样品的抗原或抗体，ELISA试验中很多因素都会影响试验的结果，试验中常出现的有显色淡，灵敏度偏低、样品重复试验差异大、假阳性和假阴性等。这些都会使我们对样品的真实结果做出误判，现就ELISA试验中非正常检测结果产生的原因进行分析，寻讨其解决的办法，以提高检测的准确性。

一、显色淡，灵敏度低

1.查看试剂盒是否在有效期内，是否按照保存温度保存。试剂盒过期或保存温度过高（正常保存温度2℃～8℃）都会影响显色。

2.试剂盒从2℃～8℃冰箱取出后在室温平衡至少20～30 min。

3.温育时间不足或培养箱温度不足37℃，在ELISA试验中一定要注意温育时间和温度的重要性，在温育的过程中尽量不要打开温箱，僻免温度忽上忽下。温育时间不足，温度过低都会影响显色。

4.严格按照试剂说明书要求的洗涤方法洗涤，洗涤时加洗涤液不能冲击过大，浸泡时间过长，要按照说明书上要求的洗涤次数洗涤。

5.加样不足，加样时要按照加样量调整好移液器的刻度，使用配套，内壁光滑清洁的吸头，吸头不能交叉使用，同时要对移液器进行校准，僻免加样不足使显色不足。

6.配制洗涤液的水要用纯水机过滤的水，水质应清洁无异常，不能用酸性过大或碱性过大的水，最好用新鲜合格的蒸馏水。

二、样品重复试验差异较大

在检测过程中有时同一样品两次检测结果不一样，差异较大，这种情况可能存在以下几种原因。

1.两次检测样品数量可能不同，加样时间长短不一，反应时间长短不一，所以重复检测某一样品时，尽量与第一次加样时间一致。

2.加样量不一致，样品稀释倍数要准确，充分混匀，两次加样要使用同一个移液器。

3.温育时间和温度不一致，洗涤及操作人员不一致。重复检测样品，操作条件，人员等检测过程应与上次保持一致。

三、假阳性和假阴性

（一）样品的采集和保存

1.样品应清亮、透明、新鲜、无溶血，样品溶血后血清样品中的血红蛋白可造成假阳性。

2.样品被细菌污染，菌体中的某些物质会产生假阳性反应。

3.僻免样品反复冻融。

4.样品不清亮，样品里有可见的纤维蛋白絮状物，易造成假阳性。因而分离血清时应待血液完全凝固，血清自然析出，在分离出合格血清。

（二）加样

1.样品的稀释要按照试剂说明书上规定的稀释倍数稀释血清，避免血清中的非特异性IgG过多，这些非特异性IgG与酶标二抗反应极易出现假阳性

2.如果加入的酶结合物过多或加在较高的孔壁上或孔口，也会引起本底升高或假阳性。

（三）温育

在做ELISA试验时，一定要按照温育的时间和温度进行，温育的时间和温度的改变都会对反应有影响，因而：

1.温育时间过短，温度过低，易致显色不全。温育时间过长，温度过高，易致非特异结合物紧附于反应孔周围，难以清洗彻底，产生阴性高值或假阳性反应，因而在温育时要严格按照规定的温度和时间进行温育。

2.将反应板放入恒温箱时，反应板不能叠放，以保证反应板受热均匀，温度能迅速达到平衡。

四、洗板

1.要按照试剂说明书上的说明配制好洗涤液，配制洗涤液用水最好为新鲜的蒸馏水，配制倍数准确。

2.洗板时要按照试剂说明书上的洗涤方法洗涤，不能随意改变洗涤方法，洗涤时间，洗涤次数。

3.不同厂家，不同批次试剂的洗涤液不能混用。

4.配制洗涤液用水的质量很重要，关系试验成败，准确与否，洗涤用水最好用新鲜合格的蒸馏水。

五、OD值测定

显色完成，加终止液后将反应板放入酶标仪检测OD值。

1.在反应结束前应将酶标仪开启，预热10～20 min，仪器放置应平稳，保证仪器运转正常。

2.按照试剂说明书要求调整好酶标仪的检测波长。

3.显色结束加终止液后，应尽快测定OD值，一般在10 min内测定。

4.酶标仪不用时应放置在干燥、干净的仪器室，加盖防尘罩，同时应定期对酶标仪进行效验，确保仪器运转正常，精确。