基于壳仁分离的水飞蓟提取纯化工艺

孙小祥， 谭才宏， 陈 钧， 张业旺， 夏国华*（1.镇江市中医院药剂科，江苏镇江100；.江苏大学药学院，江苏镇江101；.江苏大学附属医院药剂科，江苏镇江1001）



基于壳仁分离的水飞蓟提取纯化工艺

孙小祥1，2， 谭才宏3， 陈 钧2， 张业旺2， 夏国华2*
（1.镇江市中医院药剂科，江苏镇江212003；2.江苏大学药学院，江苏镇江212013；3.江苏大学附属医院药剂科，江苏镇江212001）

摘要：目的 研究在壳仁分离条件下，以水飞蓟制备纯化水飞蓟宾的工艺。方法 水飞蓟脱壳后，其壳的乙酸乙酯提取物用乙醇洗脱纯化，并以水飞蓟宾纯度和得率为指标，采用中心组合设计-响应面法优化工艺。结果 最佳条件是以80%乙醇为洗脱溶剂，液固比1.1，洗脱4次，所得水飞蓟宾纯度为82%，得率为80%。70%乙醇重结晶后，其含有量为97.3%，产率为1.090%。结论 该工艺可提高水飞蓟的综合利用，而且简单可行，成本低廉，具有很好的工业应用价值。

关键词：水飞蓟；水飞蓟宾；壳仁分离；中心组合设计-响应面法

中药水飞蓟Silybi Fructus为菊科水飞蓟属植物水飞蓟Silybum marianum（L.）Gaertn的干燥成熟瘦果，作为经济作物，由德国引种入我国，并被《中国药典》收录［1］。其主要有效成分水飞蓟宾（si1ybin，SLB）为理想的肝损伤修复药物［2-3］，市场需求量极大，目前已经有水飞蓟宾片剂、胶囊、脂质体等多种制剂上市。

水飞蓟的果皮（水飞蓟壳）与种仁（水飞蓟仁）比重接近，但在化学成分和生物活性上有很大的差异［4-6］，水飞蓟宾主要分布于果皮中，而在种仁中的含有量极低［7］，但水飞蓟瘦果果皮坚硬，对种仁包裹紧密，脱壳困难。目前，生产上主要是将水飞蓟冷轧取油，以压榨后的水飞蓟粕提取水飞蓟素，进一步纯化后得到水飞蓟宾［8］，但该工艺提取率低，生产周期长，单位能耗高［9］。因此，为了实现水飞蓟资源的高效综合利用，本实验以水飞蓟的壳仁分离技术为基础，建立一种新型的提取纯化工艺，为制药工业中水飞蓟宾的生产提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 水飞蓟脱壳机（本实验室专利［10］）；TG328A电子分析天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；I-205旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）；UV2401紫外-可见分光光度计、LC-20A HPLC色谱仪（日本Shimadzu公司）。

1.2 材料 水飞蓟药材（江苏中兴药业有限公司），由江苏大学药学院陈红霞副教授鉴定为菊科植物水飞蓟Silybum marianum（L.）Gaertn的干燥成熟果实，标本（编号SP20121101）保存于江苏大学药学院标本室。水飞蓟宾对照品（中国食品药品检定研究院，批号0856-201203，经HPLC测定，纯度≥98%）。甲醇为色谱纯（江苏汉邦化学试剂有限公司）；其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 水飞蓟宾含有量测定［1，11］

2.1.1 溶液配制 精密称取水飞蓟宾对照品32.0 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容，即得对照品贮备液。再精密称取水飞蓟宾粗品或精制品35.0 mg，置于50 mL量瓶中，甲醇定容，即得供试品溶液。

2.1.2 色谱条件 Venusi1ASB C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇-2.0%冰醋酸水溶液（45∶55）；进样量20 μL；体积流量1.0 mL/min；检测波长288 nm；柱温室温。

2.1.3 标准曲线 精密吸取贮备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置于25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，进样测定。以质量浓度（μg/mL）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得回归方程Y＝61 043X-20 548，r＝0.999 5，表明水飞蓟宾在1.888～11.328 μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.4 样品测定 精密吸取样品溶液5.0 mL，按“2.1.3”项下方法操作。

2.2 水飞蓟瘦果壳仁分离 取干燥的水飞蓟药材3 kg，以1 kg/m in的速率匀速加入脱壳机中，200目尼龙袋在出料口收集脱出物。将其用16目筛除去粉碎物后（称定质量，计算粉碎率），振动筛选出未脱壳的药材（称重，计算脱壳率），再经风选以实现壳与仁的分离，备用。

2.3 水飞蓟宾粗提物制备 将水飞蓟壳粉碎，过40目筛，精密称取15.0 g，加乙酸乙酯90 mL，80℃回流2 h，抽滤，滤渣同法再提取一次，合并滤液，减压浓缩回收溶剂，石油醚（60～90℃）洗涤浸膏2次，挥干石油醚，即得［12］。

2.4 粗提物的纯化 精密称取水飞蓟宾粗提物5.0 g，加入一定比例的乙醇溶液，涡旋1 min，静置5 min后离心，烘干离心固体，称定质量，HPLC法测定水飞蓟宾的纯度，得到优质的水飞蓟提取物原料（水飞蓟素）或水飞蓟宾原料中间体。

根据中心组合设计原理，以Z（水飞蓟宾的得率× 50%＋水飞蓟宾的纯度×50%）为响应值，以影响SLB纯化的乙醇体积分数、液固比为自变量，进行两因素五水平的响应面分析试验［13］，结果见表1。

表1 试验因素和水平

2.5 水飞蓟宾精制 取水飞蓟宾原料中间体5.0 g，加无水乙醇200 mL，加热回流3 h溶解，缓慢加入微沸水86 mL稀释后，继续回流1 h，放冷，4℃冰箱放置过夜，离心，收集析出物，60℃下烘干。按比例重复上述过程，HPLC法测定水飞蓟宾含有量，按下式计算产率。

2.6 对比试验［12］取水飞蓟原药材50 g，按照传统冷轧提取工艺制备水飞蓟宾。另取原药材冷轧去油，得到水飞蓟粕后，参照本工艺同法操作，计算产率，并与本工艺进行比较。

3 结果与分析

3.1 HPLC色谱图 按“2.1.3”和“2.1.4”项下方法操作，得到水飞蓟宾对照品、粗提物和精制品的HPLC色谱图，见图1。

图1 水飞蓟宾产物HPLC图

3.2 壳仁分离效果 采用自制水飞蓟脱壳机，脱壳率95%以上，粉碎率小于3%，脱壳效果见图2。

图2 水飞蓟脱壳效果图

3.3 响应面优化纯化工艺 试验结果见表2。

表2 试验结果

采用Design Expert 8.05软件，对表中的Z项数据进行多元回归拟合，得到回归方程Z＝-2.185 9＋1.435 1A＋0.056 2B＋0.010 1AB-1.035 8A2-0.000 4B2。方差和可信度分析见表3、表4。

表3 方差分析结果

表4 回归方程可信度分析

由表3、表4可知，该模型失拟项显著（P＜0.05），而决定系数（P＞0.05）不显著，说明方程的拟合度和可信度均良好。另外，因素A、A2、B2对试验结果影响显著，而B和交互项AB影响不显著，故该模型可用于水飞蓟粗提物的纯化。

由响应面分析图（图3）可知，水飞蓟提取物的最佳纯化工艺为79.39%乙醇，液固比1.08，洗脱4次。

图3 响应面分析图

以80%乙醇为洗脱溶剂，液固比1.1，洗脱4次，平行3次进行验证试验，结果见表5，得Z值为0.819 8 （ISD为0.13%），接近预测值0.820 2，说明该模型可靠。在该工艺条件下，水飞蓟宾纯度为82%，得率为80%，故可作为优质的水飞蓟提取物原料或水飞蓟宾中间体产品。

表5 模型验证试验

3.4 水飞蓟宾精制结果 取最优工艺下3批水飞蓟宾中间体原料，按“2.5”项下方法进行重结晶操作，结果见表6。

表6 高纯度水飞蓟宾精制结果

3.5 对比试验结果 按照本工艺操作，从50 g水飞蓟原药材中制备的水飞蓟宾产率为1.18%，而传统工艺下为0.73%。

4 结论与讨论

本实验比较了硅胶柱色谱层析法、D101大孔吸附树脂法和重结晶法对水飞蓟宾粗提物精制的效果。结果发现，硅胶柱色谱精制水飞蓟宾的纯度最高，但是需用大量溶剂，成本较高，产率较低，而大孔吸附树脂的纯度较低。因此，本实验选择重结晶法。

水飞蓟宾常用的重结晶溶剂一般有甲醇、乙酸乙酯、丙酮以及混合溶剂系统，其中以甲醇和乙醇的精制产率为高［9］，考虑到甲醇的毒性，本实验选择乙醇作为重结晶溶剂。研究发现，乙酸乙酯粗提物杂质在无水乙醇中的溶解度远大于水飞蓟宾，两者的质量浓度近似呈现5∶1～6∶1的关系。同时，水飞蓟宾在70%乙醇中的溶解度较低（13.23 mg/mL），而该溶剂对杂质仍有理想的溶解能力（70.71 mg/mL）。因此，结晶时先用无水乙醇溶解水飞蓟宾粗品中的杂质成分及部分水飞蓟宾，再加水形成70%乙醇，使水飞蓟宾的溶解度降低，进而析出该成分，而杂质成分未达到饱和，并不析出，以达到除杂的目的。

另外，本实验对纯化后的乙醇洗脱液进行LC-MS分析，发现其中含有二氢槲皮素、水飞蓟亭、水飞蓟宁、水飞蓟宾、异水飞蓟宾等成分，为后续从该结晶液中回收各活性单体提供参考。

综上所述，本实验将中药水飞蓟脱壳后，制备优质的水飞蓟提取物和高纯度水飞蓟宾，该工艺以水飞蓟综合利用为宗旨，简单可行，成本低廉，具有较高的工业应用价值。

参考文献：

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2015年版一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2015：82.

［2］ F1ora K，Habn M.Mi1k thist1e（Silybum marianum）for the therapy of 1iver disease［J］.Am J Gastroenterol，1998，93 （13）：139-143.

［3］ Kvasnicka F，Biba B，Seveik I，et al.Ana1ysis of the active components of si1ymarin［J］.JChromatogr A，2003，99（10）：239-245.

［4］ 陶立平，张亚茹，张宪有，等.水飞蓟油对兔实验性主动脉粥样硬化病变影响的观察［J］.佳木斯医学院学报，1995，18（5）：17-19.

［5］ 何维明，许牡丹，杨 蓄，等.水飞蓟油的营养成分及降脂作用研究［J］.营养学报，1996，18（2）：163-167.

［6］ 《水飞蓟的综合利用》编辑组.水飞蓟的综合利用［M］.北京：科学出版社，1980.

［7］ 尚 炜，才 松，杨彦春.水飞蓟种壳与种子总黄酮含量比较［J］.中国中医科技，1995，2（5）：24-25.

［8］ 董 岩，孔春燕.水飞蓟有效成分的提取研究［J］.中成药，2010，32（7）：1225-1226.

［9］ 史劲松，孙达峰，顾龚平，等.水飞蓟素提取工艺的改进和探讨［J］.中国野生植物资源，2006，25（6）：52-54.

［10］ 陈 钧，刘忠德，陈庶来，等.一种水飞蓟籽脱壳机：中国，201691021［P］.2011-01-05

［11］ 张春晓，陈 华，刘友彬，等.从水飞蓟粕及水飞蓟壳中提取水飞蓟素及水飞蓟宾的比较研究［J］.中成药，2013，35（10）：2137-2141.

［12］ Tan C，Xu X，Shang Y，et al.A nove1approach for the efficient extraction of si1ybin from mi1k thist1e fruits［J］.Pharmacogn Mag，2014，10（40）：536-540.

［13］ Gracie1e D，Franci1ene G，Cristiane C，et al.Optimization of the extraction of f1avano1sand anthocyanins from the fruitpu1p of Euterpe edulis using the response surface methodo1ogy［J］. Food Res Int，2011，44（3）：708-715.

*通信作者：夏国华，男，实验师，研究方向为中药提取及分离。E-mai1：xgh-78131@yeah.net

作者简介：孙小祥（1972—），男，硕士，副主任药师，研究方向为生药资源。E-mai1：412354487@qq.com

基金项目：镇江市科技计划项目（HS2014069）；江苏省药学会—百特生物药学基金（201543）

收稿日期：2015-03-17

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.046

中图分类号：I284.2

文献标志码：B

文章编号：1001-1528（2016）02-0686-04