基于毛细管电泳的鹿鞭DNA指纹鉴定方法

苑广信， 李梓僮， 张丽华， 盛 瑜， 李洪宇， 李 坦， 孙 新， 李明成（.北华大学药学院，吉林吉林303；.北华大学生命科学中心，吉林吉林303；3.北华大学医学检验学院，吉林吉林303）



基于毛细管电泳的鹿鞭DNA指纹鉴定方法

苑广信1， 李梓僮1， 张丽华1， 盛 瑜1， 李洪宇1， 李 坦2， 孙 新2， 李明成3*
（1.北华大学药学院，吉林吉林132013；2.北华大学生命科学中心，吉林吉林132013；3.北华大学医学检验学院，吉林吉林132013）

摘要：目的 研究基于毛细管电泳的鹿鞭DNA指纹鉴定方法。方法 盐析法提取梅花鹿鞭、马鹿鞭、驯鹿鞭和赤鹿鞭的线粒体DNA，对序列为GAGCGTCGAA的引物进行IAPD扩增，毛细管电泳法分析其产物，再对所得指纹图谱的相似度进行分析。结果 梅花鹿鞭指纹图谱中有9个共有峰，马鹿鞭指纹图谱中有21个共有峰，与驯鹿鞭和赤鹿鞭有明显差异。而且，其相似度均小于0.7。结论 该方法客观、准确、方便，可有效区分梅花鹿鞭、马鹿鞭及其伪品（驯鹿鞭、赤鹿鞭）。

关键词：鹿鞭；DNA指纹；毛细管电泳

KEY W 0RDS：Penis et Testis Cervi；DNA fingerprints；capi11ary e1ectrophoresis

鹿鞭是我国的传统名贵中药材，为鹿科动物梅花鹿（Gervus nippon Temminck）和马鹿（Cervus elaphus Linnaeus）雄性的外生殖器［1］。中医认为，鹿鞭可以补肾精、壮肾阳，对于治疗腰膝冷痛、阳痿早泄有显著疗效［2］。近年来，由于市场需求量大、货紧价高等原因，各种伪品屡见不鲜，其中驯鹿（Rangifer tarandus）和赤鹿（Cervus canadensis）由于数量多、价格便宜，常被用于冒充正品鹿鞭出售。但鹿鞭成分复杂，而且市售品大多经过加工、炮制，导致性状和成分均有所改变，故传统方法很难进行准确鉴别。

DNA指纹法利用DNA在分子水平上，对物种进行鉴别，具有高度的种质特异性，比传统鉴定方法更科学和准确［3-4］。其中，随机扩增DNA多态性（IAPD）技术具有扩增结果多态性丰富、DNA用量少、无需专门设计引物等优点，近年来在物种鉴定方面得到了广泛应用［5］。另外，毛细管电泳具有快速、高效、样品用量少、抗污染等优点，在蛋白质、核酸、DNA、氨基酸等生物样品分析中具有独特优势［6-7］。本实验将毛细管电泳和IAPD技术相结合，建立鹿鞭IAPD指纹鉴定方法，并采用相似度分析软件对结果进行判定，旨在为鹿鞭的鉴定提供一种科学、准确、客观的新方法。

1 仪器与试药

毛细管电泳仪（美国Agi1ent公司）；9700PCI扩增仪（美国ABI公司）；ST16I台式低温离心机（美国Thermo公司）；未涂层石英毛细管（75 μm×50 cm，40 cm，河北永年锐沣色谱器件有限公司）。

梅花鹿鞭1号、马鹿鞭1号购自吉林市龙潭山鹿业有限责任公司；梅花鹿鞭2号、马鹿鞭2号购自蛟河市第一鹿场；梅花鹿鞭3号、马鹿鞭3号购自吉林市药材市场；驯鹿鞭1号、赤鹿鞭1号由吉林市食品药品检验所提供；驯鹿鞭2号、赤鹿鞭2号由四平市食品药品检验所提供。

DNA聚合酶、蛋白酶K、裂解液（含10 mmo1/L Tris-HC1［pH＝7.6］、10 mmo1/L Na2EDTA、50 mmo1/L NaC1）、2×Taq PCI Master Mix购自北京天根生化科技有限公司；DL-1000 DNA marker购自日本TaKaIa公司；四丁基磷酸铵（TBAP）购自美国Sigma公司；羟丙甲基纤维素（HPMC）和随机引物购自上海生工生物有限公司。甲醇为色谱纯；水为自制双蒸水；其他试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 鹿鞭线粒体DNA提取 取鹿鞭样品适量，洗净、烘干、剪碎，于研钵中研成粉末，4℃下保存待用。盐析法［8］提取鹿鞭线粒体DNA，取粉末0.1 g，置于离心管中，加裂解液0.5 mL、10% SDS 30 μL和蛋白酶K 15 μL，55℃水浴恒温震荡12 h，加饱和醋酸钠溶液500 μL，继续震荡10 min，离心10 min（12 000 r/min），取上清液，加入等体积异丙醇，-20℃下静置3 h，离心10 min（12 000 r/min），弃去上清液。沉淀加70%乙醇洗涤，离心10 min（12 000 r/min），弃去上清液，挥干乙醇，加灭菌蒸馏水100 μL溶解，即得DNA样品溶液，-20℃下保存待用。

2.2 鹿鞭线粒体DNA琼脂糖凝胶电泳 取DNA样品溶液，按6∶1的比例加入6×1oading buffer，混匀，于0.8%琼脂糖凝胶板（含0.5 μg/mL EB）上点样，进行电泳。电压60 V，电泳时间1 h，记录紫外检测结果。

2.3扩增引物的筛选 用合成的30条10-mer引物，分别对提取的鹿鞭线粒体DNA进行扩增，从中筛选出多态性丰富、扩增结果稳定的引物，进行下一步研究。

2.4 IAPD扩增 PCI反应体系总体积为25 μL，含2×Taq PCI Master Mix 12.5 μL、12.5 μmo1/L引物1 μL，模板DNA溶液2 μL和无菌蒸馏水9.5 μL。

PCI循环参数为预变性5 min（94℃），变性80 s（94℃），退火1 min（36℃），延伸2 min （72℃），40个循环后再延伸10 min（72℃）。首循环变性3 min（95℃），PCI产物在4℃下保存待用。

2.5 毛细管电泳分析 参考文献［9］，并进行优化，缓冲液为0.8% HPMC-2 mmo1/L EDTA-15 mmo1/L TBAP-20 mmo1/L磷酸盐缓冲液，Tris调节pH为7.3；分离电压-8 kV；进样电压-10 kV；进样时间15 s；检测波长260 nm，记录电泳图谱。

新毛细管依次用甲醇、蒸馏水、1.0 mo1/L盐酸、1.0 mo1/L NaOH溶液各冲洗15 min，0.1 mo1/L NaOH溶液冲洗30 min，再用蒸馏水和缓冲液各冲洗10 min，备用。每次进样前，依次用0.1 mo1/L NaOH溶液、蒸馏水和缓冲液各冲洗2 min。2.6 数据分析 将所得的电泳图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）》软件，进行相似度分析和鉴定。

3 实验结果

3.1 线粒体DNA琼脂糖凝胶电泳图谱 由图1可知，鹿鞭线粒体DNA条带清晰完整，无明显弥散和降解，相对分子量约为21 000 bp，表明采用“2.1”项下方法，可从鹿鞭干品中获得完整、高纯度的线粒体DNA，这为IAPD扩增的稳定提供了一级结构基础。

图1 鹿鞭线粒体DNA琼脂糖凝胶电泳图谱Fig.1 M itochondrial DNA agarose gel electropherograms of Penis et Testis Cervi

3.2 扩增引物的筛选 通过逐步筛选，发现序列为GAGCGTCGAA的引物扩增结果重复性好、多态性丰富、特异性强，故选择该引物用于IAPD扩增。

3.3 IAPD扩增条件的优化 退火温度、模板DNA用量和引物用量是影响IAPD扩增的主要因素。

3.3.1 退火温度 在33～38℃下，随着退火温度的升高，IAPD反应的特异性增强，但温度过高则会影响DNA链的聚合。实验结果显示，退火温度36℃时，扩增效果最好。

3.3.2 模板DNA用量 在0.3～0.8 μg范围内，考察了模板DNA用量对扩增结果的影响。结果显示，模板DNA用量为0.5 μg时，扩增效果最好。3.3.3 引物用量 在0.5～2.0 μg范围内，考察了引物用量与扩增结果的关系，发现引物用量越大，IAPD反应越完全，但过大则会产生引物二聚体。结果显示，当引物用量为1 μg时，扩增效率最高，而且无引物二聚体产生。

3.4 方法学验证

3.4.1 精密度试验 取DL-1000 DNA marker适量，制成90 μg/mL溶液，在“2.5”项条件下连续测定6次。结果，各DNA片段电泳峰面积和迁移时间的ISD分别为2.9～5.6%和1.1～1.9%，表明仪器精密度良好。

3.4.2 重复性试验 取梅花鹿鞭1号样品适量，分成5份，分别按“2.1”和“2.4”项下方法提取DNA和IAPD扩增，然后在“2.5”项条件下测定。结果，各主要扩增片段电泳峰面积和迁移时间的ISD分别为2.7～5.9%和1.3～1.9%，表明该方法重复性良好。

3.5 基于毛细管电泳的鹿鞭IAPD指纹图谱的构建 取梅花鹿鞭1～3号和马鹿鞭1～3号样品适量，分别按“2.1”和“2.4”项下方法操作，然后在“2.5”项条件下测定，记录电泳图谱，并将数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）》进行分析。结果，梅花鹿鞭指纹图谱标定了9个共有峰，相对保留时间的ISD＜0.45%，相似度在0.952～0.983之间；马鹿鞭指纹图谱标定了21个共有峰，相对保留时间的ISD＜0.78%，相似度在0.945～0.969之间。具体见图2。

3.6 鹿鞭样品的鉴定 取驯鹿鞭和赤鹿鞭样品适量，分别按“2.1”和“2.4”项下方法提取DNA 和IAPD扩增，然后在“2.5”项条件下测定。将所得的指纹图谱与梅花鹿鞭、马鹿鞭进行对比，计算相似度，结果见表1。由表可知，梅花鹿鞭、马鹿鞭、驯鹿鞭和赤鹿鞭指纹图谱具有明显差异，相似度均小于0.7，说明该方法可用于梅花鹿鞭、马鹿鞭及其伪品（驯鹿鞭和赤鹿鞭）的鉴定。

图2 4种鹿鞭的电泳图谱Fig.2 Electrophoretograms of four kinds of Penis et Testis Cervi

表1 4种鹿鞭指纹图谱的相似度Tab.1 Sim ilarities of the fingerprints of four kinds of Penis et Testis Cervi

4 讨论

随机扩增DNA多态性（IAPD）分析技术与其它分子标记技术相比，具有无需专门设计引物、多态性丰富、检出率高、技术简便、快速、易于程序化、样品量少等优点，因此被广泛用于物种的鉴定和遗传学研究［10-11］。但由于缺乏合适的检测技术和鉴定方法，导致相关研究成果的应用性不强。

毛细管电泳与IAPD技术联用时，可发挥后者的优势并有效弥补其缺点：（1）毛细管电泳分辨率极高（可分离相差1 bp的DNA片段），两者联用可体现IAPD扩增产物的多态性，获得多态性丰富的DNA指纹图谱；（2）毛细管电泳灵敏度高，两者联用可检测到IAPD扩增产物中含有量较低的片段，获得信息量更大、更完整的DNA指纹图谱；（3）毛细管电泳分析速度快，可明显缩短IAPD扩增产物的分析时间，更适合大批量样品的分析；（4）毛细管电泳分离IAPD扩增产物的同时，还可测定各扩增片段的浓度和分子量，获得更丰富的信息，有利于建立更全面的指纹图谱；（5）毛细管电泳可获得数据形式的分析结果，然后导入软件进行相似度分析。

本实验建立了基于毛细管电泳的鹿鞭DNA指纹鉴别方法，实验结果表明，该方法准确、可靠、重复性好。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》分析时发现，梅花鹿鞭、马鹿鞭、驯鹿鞭和赤鹿鞭指纹图谱的相似度具有明显差异，说明该方法可有效区分梅花鹿鞭、马鹿鞭及其伪品（驯鹿鞭和赤鹿鞭），为该药材的鉴定提供了一种客观、准确、方便的手段。

参考文献：

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DNA fingerprint identification of Penis et Testis Cervi based on capillary electrophoresis

YUAN Guang-xin1， LIZi-tong1， ZHANG Li-hua1， SHENG Yu1， LIHong-yu1， LI Tan2， SUN Xin2， LIMing-cheng3*

（I.College of Pharmacy，Beihua University，Jilin I32OI3，China；2.Life Scientific Research Center，Beihua University，Jilin I32OI3，China；3.Medical Inspection Institute，Beihua University，Jilin I32OI3，China）

ABSTRACT：AIM To study the DNA fingerprint identification of Penis et Testis Cervi based on capi11ary e1ectro-book=621,ebook=155phoresis.METH 0 DS Themitochondria1DNAs of Penis et Testis Cervi of Cervus nippon Temminck，Cervus elaphus Linnaeus，Rangifer tarandus and Cervus canadensis were extracted by sa1ting-out method.The primer （GAGCGTCGAA）was used for IAPD amp1ification，whose products were ana1yzed by capi11ary e1ectrophoresis. Then the simi1arities of obtained fingerprintswere ana1yzed.RESULTS Therewere nine and twenty-one common peaks in the fingerprints of Penis et Testis Cervi of C.nippon and C.elaphus，respective1y，having obvious difference from those of R.tarandus and C.canadensis.In addition，their simi1aritieswere 1ess than 0.7.C0NCLUSI0 N Thismethod is objective，accurate and simp1e，which can effective1y distinguish C.nippon and C.elaphus from their counterfeits（R.tarandus and C.canadensis）.

*通信作者：李明成（1964—），男，博士，教授，从事中药DNA指纹图谱研究。Te1：（0432）64608281，E-mai1：1imingcheng1964@ 163.com

作者简介：苑广信（1981—），男，博士，副教授，从事中药质量控制技术研究。Te1：（0432）64608281，E-mai1：yuanguangxin2007@ 163.com

基金项目：吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目（吉教科合字［2012］143、［2014］212号）；吉林省战略性新兴产业和高新技术产业发展专项资助（2015Y077，2013G030，2013G019）

收稿日期：2015-08-03

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.030

中图分类号：I282.5

文献标志码：A

文章编号：1001-1528（2016）03-0620-05