姜黄素对骨肉瘤U2OS细胞系增殖、凋亡及侵袭的影响

王军，陈鹏（山东大学第二医院，济南250033）

姜黄素对骨肉瘤U2OS细胞系增殖、凋亡及侵袭的影响

王军，陈鹏
（山东大学第二医院，济南250033）

目的 探讨姜黄素对人骨肉瘤U2OS细胞系增殖、凋亡及侵袭的影响。方法 取处于对数生长期的人骨肉瘤U2OS细胞，随机分为4组，A、B、C、D组分别加入PBS缓冲液、姜黄素5、10、20 μmol/L，采用MTT法测算各组细胞生长抑制率，流式细胞术检测各组细胞凋亡情况，Transwell细胞侵袭实验观察细胞侵袭能力变化。结果A、B、C、D组第48小时细胞生长抑制率分别为0、13.2±2.5、23.6±4.3、41.5±6.2，第72小时细胞生长抑制率分别为0、23.1±5.1、43.2±2.7、65.7±7.3，与同组48 h比较差异均有统计学意义（P均＜0.05）。随着姜黄素浓度的升高，U2OS细胞的凋亡指数明显增高，呈浓度依赖性。U2OS细胞培养24 h后A、B、C、D组细胞凋亡指数分别为10.01%、18.76%、24.68%、42.81%。四组间两两比较，P均＜0.05。U2OS细胞培养72 h后A、B、C、D组每高倍镜下穿膜细胞数目分别为96.8±8.2、82.4±7.1、76.3±6.5、53.4±3.3，C、D组与A组比较，P均＜0.05。结论 姜黄素对人骨肉瘤细胞系增殖有明显的抑制作用，且呈浓度及时间依赖性，能诱导细胞凋亡，降低细胞侵袭能力。

骨肉瘤；姜黄素；细胞凋亡；细胞侵袭

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.25.012

骨肉瘤发病约占所有骨恶性肿瘤的30%，目前用于化疗的药物不良反应较大，有可能进一步降低骨肉瘤患者的生存率［1］。姜黄素是传统中药，人体耐受性良好［2］。研究表明，姜黄素对肝癌、胃癌、胰腺癌等肿瘤具有较明显的抗癌作用，但目前关于姜黄素对人骨肉瘤细胞作用规律的研究较少［3］。2014 年5月～2015年12月，我们通过观察不同浓度姜黄素对人骨肉瘤U2OS细胞系的抑制作用，分析姜黄素对U2OS细胞系增殖、凋亡及侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人骨肉瘤U2OS细胞系（中国科学院上海细胞库）；DMEM培养基（GIBCO-BR公司）、新生牛血清（杭州四季青生物制品有限公司）；细胞培养箱（英国Galaxy公司）；姜黄素（Sigma公司）；细胞凋亡检测试剂盒（eBioscience，San Diego）；FACSCalibur细胞分析仪（Becton Dickinson，MountainView）。

1.2 细胞培养及分组 人骨肉瘤U2OS细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养，细胞贴壁生长。实验细胞随机分为4组，A组为空白对照组，加入PBS缓冲液；B、C、D组培养液中姜黄素的浓度分别为5、10、20 μmol/L。

1.3 细胞增殖能力检测 采用MTT法。取对数生长期人骨肉瘤U2OS细胞，以1×104/孔接种于96孔板，培养12 h，按照预先分组，A、B、C、D组分别加入PBS缓冲液和5、10、20 μmol/L姜黄素，继续培养48～72 h。向各孔中分别加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，继续培养4 h。向各孔中分别加入150 μL二甲基亚砜，振荡10 min使结晶充分溶解。于酶标仪490 nm波长处分别测量各孔的吸光度值。细胞生长抑制率（IR）=（1-加药组吸光度值/对照组吸光度值）×100%。

1.4 细胞凋亡检测 采用流式细胞术。取对数生长期U2OS细胞接种于12孔板（1.5×105/孔），A、B、C、D组分别加入PBS缓冲液和5、10、20 μmol/L姜黄素，培养24 h，收集细胞。采用凋亡检测试剂盒进行检测。悬浮于缓冲液中的细胞，室温下于暗室用AnnexinV-FITC和碘化丙啶孵育15 min。应用CellQuest软件，通过FACSCalibur细胞分析仪进行分析。Annexin V阳性的细胞为凋亡细胞，记录各组细胞凋亡指数。

1.5 细胞侵袭能力检测 用无血清DMEM培养基按1∶19稀释Matrigel，取50 μL铺于Transwell小室上室，A、B、C、D组U2OS细胞分别加入PBS缓冲液和5、10、20 μmol/L姜黄素处理，取处理过的U2OS细胞100 μL；下室加入含10%血清的DMEM培养基500 μL；24 h后取出小室，膜下表面的细胞用PBS洗一遍；甲醇固定并结晶紫染色。将附着于膜下表面的细胞于高倍镜下（×100）随机取5个视野计数，取平均数。重复实验2次。

1.6 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计量数据以±s表示，两组间比较采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素对U2OS细胞增殖能力的影响 随着姜黄素浓度的升高，U2OS细胞系增殖受到显著抑制，受抑制程度呈浓度依赖性。A、B、C、D组第48小时细胞生长抑制率分别为0、13.2%±2.5%、23.6%±4.3%、41.5%±6.2%，第72小时细胞生长抑制率分别为0、23.1%±5.1%、43.2%± 2.7%、65.7%±7.3%，与同组48 h比较差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

2.2 姜黄素对U2OS细胞凋亡的影响 随着姜黄素浓度的升高，U2OS细胞的凋亡指数明显增高，呈浓度依赖性。U2OS细胞培养24 h后A、B、C、D组细胞凋亡指数分别为10.01%、18.76%、24.68%、42.81%。四组间两两比较，P均＜0.05。

2.3 姜黄素对U2OS细胞侵袭能力的影响 U2OS细胞培养72 h后，A、B、C、D组每100倍镜下穿膜细胞数分别为96.8±8.2、82.4±7.1、76.3±6.5、53.4±3.3，C、D组与A组比较，P均＜0.05。

3 讨论

骨肉瘤是最常见的骨恶性肿瘤，小儿发病率较高。骨肉瘤发病的第一个高峰是青春期，第二个高峰是65岁以后。美国骨肉瘤的发生率约为400例/年。在中国的发病率约为4/100万。骨肉瘤的10生存率为60%～75%。目前骨肉瘤的治疗一般采取术前化疗，截肢术或保留肢体的肿瘤切除术，术后化疗。目前用于化疗的药物对于骨肉瘤细胞和人体正常细胞均有明显的杀伤作用，不良反应较大。

姜黄素对多种肿瘤有抗癌作用，其可作用于多种分子及细胞传导通路，在基因表达、转录、细胞增殖和细胞外基质合成等过程中发挥重要作用［4］。姜黄素不仅通过抑制多个基因而抑制肿瘤的细胞增殖，且能影响肿瘤增殖相关的多种生长受体和细胞黏附分子［5］。在包括骨肉瘤的多种肿瘤细胞系中，姜黄素均能上调肿瘤抑制基因的表达［6］。

既往研究［7，8］表明，Bax、Cleaved PARP表达增高，Bcl-2表达降低均会明显促进骨肉瘤细胞的凋亡。miR-138被认为与骨肉瘤的凋亡有关，miR-138的表达量增大，将会抑制Smad4、NF-κB、p65和Cyclin D3等基因的表达，从而抑制骨肉瘤细胞的增殖，促进骨肉瘤细胞的凋亡［9］。研究表明，姜黄素能对多个靶点、多个传导通路发生作用；以上传导通路均可能受到姜黄素调节，从而发挥促进骨肉瘤细胞凋亡的作用。

本实验结果显示，姜黄素干预后骨肉瘤细胞系的增殖受到明显抑制，凋亡水平明显增高，组间差异有统计学意义。姜黄素对骨肉瘤细胞的抑制呈浓度依赖性和时间依赖性，差异有统计学意义。本研究中Transwell细胞侵袭实验证明，相对于A组，C、D组骨肉瘤细胞的侵袭能力明显下降，差异有统计学意义；表明在较高浓度姜黄素作用下，骨肉瘤细胞的侵袭能力会受到抑制。

目前关于姜黄素对人骨肉瘤U2OS细胞影响的研究较少，本研究结果显示，姜黄素对人骨肉瘤细胞系增殖有明显的抑制作用，且呈浓度及时间依赖性，能诱导细胞凋亡，降低细胞侵袭能力。姜黄素在水中的溶解度低，且在人体中的代谢率高，临床应用受限。未来研究中需为姜黄素寻找一种合适的载体，使其既能溶于水，又能避免退变，并能有效地释放到作用靶区。

［1］McTiernan A，Jinks RC，Sydes MR，et al.Presence of chemotherapy-induced toxicity predicts improved survival in patients with localised extremity osteosarcoma treated with doxorubicin and cisplatin：a report from the European Osteosarcoma Intergroup［J］.Eur J Cancer，2012，48（5）：703-712.

［2］Guo Y，Shu L，Zhang C，et al.Curcumin inhibits anchorage-independent growth of HT29 human colon cancer cells by targeting epigenetic restoration of the tumor suppressor gene DLEC1［J］.Biochem Pharmacol，2015，94（2）：69-78.

［3］Xu XB，Chen B，Liu WY.Curcumin inhibits the invasion of thyroid cancer cells via down-regulation of PI3K/Akt signaling pathway［J］.Gene，2014，546（2）：226-232.

［4］Strimpakos AS，Sharma RA.Curcumin：preventive and therapeutic properties in laboratory studies and clinical trials［J］.Antioxid Redox Signal，2008，10（3）：511-545.

［5］Wilken R，Veena MS，Wang MB，et al.Curcumin：a review of anti-cancer properties and therapeutic activity in head and neck squamous cell carcinoma［J］.Mol Cancer，2011（10）：12.

［6］Collins HM，Abdelghany MK，Messmer M，et al.Differential effects of garcinol and curcumin on histone and p53 modifications in tumour cells［J］.BMC Cancer，2013，13：37.

［7］Hu W，Xiao Z.Formononetin Induces Apoptosis of Human Osteosarcoma Cell Line U2OS by Regulating the Expression of Bcl-2， Bax and MiR-375 In Vitro and In Vivo［J］.Cell Physiol Biochem，2015，37（3）：933-939.

［8］Ni B，Bai FF，Wei Y，et al.Apoptosis induced by lipid-associated membrane proteins from Mycoplasma hyopneumoniae in a porcine lung epithelial cell line with the involvement of caspase 3 and the MAPK pathway［J］.Genet Mol Res，2015，14（3）：11429-11443.

［9］Yu D，An F，He X，et al.Curcumin inhibits the proliferation and invasion of human osteosarcoma cell line MG-63 by regulating miR-138［J］.Int J Clin Exp Pathol，2015，8（11）：14946-14952.

R738

A

1002-266X（2016）25-0039-03

陈鹏（E-mail：0356154@fudan.edu.cn）

2016-03-10）