PDX-1在人脂肪间充质干细胞分化为胰岛分泌细胞中的作用

白国立，谭雪莹，史光军（青岛大学医学院附属青岛市市立医院，山东青岛266000）

PDX-1在人脂肪间充质干细胞分化为胰岛分泌细胞中的作用

白国立，谭雪莹，史光军
（青岛大学医学院附属青岛市市立医院，山东青岛266000）

目的 探讨胰十二指肠同源盒基因1（PDX-1）在人脂肪间充质干细胞（ADSC）分化为胰岛分泌细胞中的作用。方法 取复苏冻存的ADSC，随机分为实验组与对照组，实验组采用腺病毒转染方法将PDX-1转入ADSC，对照组无腺病毒感染。Western blotting法检测实验组转染结果，ELISA法检测两组细胞胰岛素分泌量，RT-PCR法检测两组胰岛分泌相关基因Ngn3和Islet-1表达。结果 转染PDX-1的ADSC于48 h后可检测到PDX-1基因的转录，而对照组则无PDX-1基因的转录。转染后15 d，实验组和对照组细胞在低糖环境下分泌的胰岛素量分别为（6.98±0.74）、（6.78±0.54）ng/mL，两组比较，P＞0.05；高糖环境下分泌的胰岛素量分别为（13.38±0.62）、（6.50±0.66）ng/mL，两组比较，P＜0.05。对照组中Ngn3和Islet-1不表达，实验组与对照组Islet-1相对表达量分别为5.150±0.177、1.000±0.089，Ngn3相对表达量分别为5.819±1.629、1.000±0.120，两组比较，P均＜0.05。结论 PDX-1基因对人脂肪间充质干细胞分化为胰岛样细胞有促进作用。

糖尿病；脂肪间充质干细胞；腺病毒；胰十二指肠同源盒基因1；胰岛分泌细胞

1型糖尿病主要由胰岛β细胞破坏导致胰岛素绝对缺乏引起［1，2］，利用干细胞技术来克服胰岛短缺的问题成为研究焦点。脂肪间充质干细胞（ADSC）与骨髓间充质干细胞有相似的细胞表型，在特定诱导培养条件下可向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞及神经细胞等定向分化，甚至可将其定向诱导为心肌细胞、角膜细胞［3，4］等。胰十二指肠同源盒基因-1（PDX-1）作为一种在胰腺发育中起重要作用的特异性转录因子，能调节胰岛β细胞功能的相关基因表达，将PDX-1基因转染某些非胰岛β细胞（如肝细胞、小肠上皮细胞）后，这些细胞可产生胰岛素［5］。2015年1～12月，我们探讨了PDX-1基因在诱导人ADSC向胰岛分泌细胞分化中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 人ADSC来自青岛市市立医院肝胆外科卫生部细胞移植实验室。DMEM/F12、DMEM-低糖和DMEM-高糖培养液购自美国HyClone公司，胎牛血清购自美国Gibco公司，双硫腙购自美国Sigma公司，人胰岛素ELISA检测试剂盒购自武汉博士德生物公司，兔抗人PDX-1单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司，携带PDX-1基因的腺病毒由美国ViGene Biosciences公司中国办事处合成，引物由Primer Premier 6软件设计，上海生物工程股份有限公司完成引物设计。

1.2 人ADSC复苏 离心管加入含10%胎牛血清的完全培养基3 mL；从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速置37℃水浴1 min至融化；打开冻存管，吸取细胞悬液至离心管，轻轻混匀；1 500 r/min离心3 min，弃上清；细胞沉淀中加入4 mL完全培养基，吹打混匀，转入35 cm培养瓶37℃常规培养，待细胞至80%～90%融合时传代，标注代数及日期。

1.3 携带PDX-1基因的腺病毒制备及ADSC转染携带PDX-1基因的腺病毒由山东维真生物科技有限公司暨美国ViGene Biosciences公司中国办事处合成：pdx-1基因由NM 00029基因序列克隆至pAD-Amp载体，本研究选用的腺病毒载体为人类血清5型腺病毒，腺病毒对其包装，载体C端带有His，Flag标签。实验组将复苏后生长状态良好的细胞传代到6孔板，保证第2天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于50%～70%。将病毒液感染复数（MOI）=50加入细胞中，培养4 h后吸去含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液，继续37℃培养48 h，收获感染后细胞。对照组采用无腺病毒感染的ADSC，其余处理同实验组。

1.4 转染后细胞PDX-1表达检测 采用Western blotting法。留取实验组、对照组转染后48 h贴壁生长的细胞用PBS冲洗2次，将细胞移至EP管中，1 500 r/min离心5 min，弃上清液，加入蛋白裂解液裂解细胞，取50 μL蛋白液与10 μL 5×上样缓冲液混合，100℃变性10 min。取提取蛋白样品，8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PYDF膜，5%脱脂奶粉封闭，兔抗人单克隆抗体作为一抗（1∶800）孵育、4℃过夜，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG作为二抗（1∶1 000）孵育2 h，化学曝光显影，β-actin做内参。测定转染后PDX-1表达情况。

1.5 葡萄糖刺激诱导后细胞胰岛素分泌水平检测采用ELISA法。细胞转染诱导15 d后，用1× PBS缓冲液缓慢冲洗2次，分别用含不同葡萄糖浓度（5.5 mmol/L和25 mmol/L）的DMEM/F12培养液孵育细胞1 h，取细胞培养液，用ELISA法测定培养液中的胰岛素含量。

1.6 胰岛分泌相关基因Islet-1、Ngn3表达检测采用RT-PCR法。将转染后15 d细胞中的培养液弃去，加入1 mL TRIzol，用1 mL枪头粗口研磨细胞至全部溶于TRLzol中，将细胞吸入1.5 mL EP管中。加入200 μL氯仿，剧烈振荡15 s，静置5 min后，12 000 r/min，离心15 min，将水相移出，加500 μL异丙醇，轻柔混匀，静置10 min后，12 000 r/ min，离心10 min，弃上清。加1 mL 75%乙醇，上下轻微摇动，洗涤沉淀；13 000 r/min，离心5 min，弃上清。将含沉淀的EP管置于通风附近，令EP管干燥完全。加DEPC 10 μL，混匀。用逆转录试剂盒将mRNA转录为cDNA。PCR反应：95℃变性30 s，95℃变性5 s，58℃退火20 s，60个循环。Ngn3正向序列：5′-AGAGCGAGTTGGCACTGAG-3′；Ngn3反向序列：5′-CTGAGAAAGCCAGACTGCC-3′；Islet-1正向序列：5′-GCCTTTGTGAACCAACACCTG-3′；Islet-1反向序列：5′-GTTGCAGTAGTTCTCCAGCTG-3′；GAPDH正向序列：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′；GAPDH反向序列5′-ATGTCGTTGTCCCACCACCT-3′。Islet-1、Ngn3表达相对量以2-ΔΔCt表示。

1.7 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计量数据以±s表示，组间比较用方差分析及t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染后细胞PDX-1表达情况 实验组转染PDX-1的ADSC于48 h后可检测到PDX-1基因的转录，而对照组则无PDX-1基因的转录。

2.2 两组葡萄糖刺激诱导后细胞胰岛素分泌水平比较 实验组和对照组细胞在低糖环境下分泌的胰岛素量分别为（6.98±0.74）、（6.78±0.54）ng/mL，两组比较，P＞0.05；高糖环境下分泌的胰岛素量分别为（13.38±0.62）、（6.50±0.66）ng/mL，两组比较，P＜0.05。

2.3 两组Islet-1、Ngn3表达比较 对照组中Ngn3 和Islet-1不表达，实验组与对照组Islet-1相对表达量分别为5.150±0.177、1.000±0.089，Ngn3相对表达量分别为5.819±1.629、1.000±0.120，两组比较，P均＜0.05。

3 讨论

ADSC具有提取方法简便、成本低廉、供体丰富等优点。目前将其诱导为胰岛分泌细胞的诱导方法主要是使用碱性成纤维生长因子、尼克酰胺、胰高血糖素样肽-1或与胰腺组织共培养等方法，但皆成本较高，不适宜进一步大规模动物实验。

PDX-1属于器官同源结构域蛋白，研究发现PDX-1基因与胰腺发育至关重要，是胰腺发育和胰腺前体细胞分化为β细胞的主要调控因子，在胚胎发育早期，PDX-1在内分泌细胞和外分泌细胞中均有表达，其能诱导内胚层向胰腺定向发育和成熟，激活后其编码的PDX-1蛋白特异性结合Ngn3基因上游启动子使其表达，进而调控Islet-1、INSM2等胰岛转录因子表达；其中Islet-1在胰腺发育早期和胰腺增殖阶段胰腺内分泌细胞成熟、增殖和存活中起重要作用，随着胰腺的发育，PDX-1最终仅限于在β细胞内表达［6～8］。近年来，由于PDX-1基因在胰岛素分泌过程中不可缺少，PDX-1在胰腺发育、分化、再生及胰岛素分泌过程中的作用受到关注［9～11］。将PDX-1基因转染某些非胰岛β细胞（如骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、肝细胞）后，这些细胞均可产生胰岛素［12，13］。

重组腺病毒是进行基因转移和表达的工具，在实验操作腺病毒过程中，需采取一定的预防措施，以保证腺病毒的安全性和转染效率。我们用携带PDX-1基因的人类血清5型腺病毒感染ADSC 48 h后，通过Western blotting法证实腺病毒对ADSC具有较高的感染能力。将PDX-1基因导入人脂肪间充质干细胞后15 d，RT-PCR法检测到胰岛分泌相关基因Ngn3和Islet-1的表达，PDX-1基因是如何诱导人ADSC分化为胰岛分泌细胞还需要进一步实验探索。

综上所述，本实验结果初步证实通过腺病毒携带PDX-1基因转染人ADSC的方式，能诱导其向胰岛分泌细胞方向分化，且在周围环境中的葡萄糖浓度升高条件下分泌胰岛素；PDX-1基因对细胞的诱导分化具有促进作用。ADSC将有望成为治疗糖尿病的细胞来源。

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Effect of PDX gene 1 in human adipose-derived mesenchymal stem cells differentiating into insulin-secreting cells

BAI Guoli，TAN Xueying，SHI Guangjun
（The Affiliated Qingdao Municipal Hospital of Qingdao University Medical College，Qingdao 266000，China）

Objective To invesitigate the effect of PDX gene 1（PDX-1）in human adipose-derived mesenchymal stem cells（ADSC）differentiating into insulin-secreting cells.Methods ADSC after cryopreservation and anabiosis were selected and then were divided into the experimental group and control group.In the experimental group，transfering PDX-1 gene into human ADSC by using the skill of adenoviral transfection method，and the control group without the adenovirus infection.The gene transfection results were detected by Western blotting，the amount of insulin secretion in the transfected cells was detected by ELISA，the expression of Ngn3 and Islet-1 was detected by RT-PCR in the two groups.Results Fifteen days after transfection，the insulin secretion under hypoglycemia of the experimental group and the control group was （6.98±0.74）and（6.98±0.74）ng/mL，respectively（P＞0.05）；the insulin secretion under hyperglycemia was （13.38±0.62）and（6.50±0.66）ng/mL，respectively；the expression of Islet-1 in the experimental group and the control group was 5.150±0.177 and 5.150±0.177，respectively；and the expression of Ngn3 in the experimental group and the control group was 5.819±1.629 and 1.000±0.120，respectively.The insulin secretion under hyperglycemia，and expression of Islet-1 and Ngn3 was higher in the experimental group as compared with that of the control group，and the difference was significant（all P＜0.05）.Conclusion PDX-1 gene plays a positive role in promoting the differentiation of human ADSC into islet-like cells.

diabetes mellitus；adipose-derived mesenchymal stem cells；adenoviruses；PDX-1；insulin-secreting cells

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.25.005

R329

A

1002-266X（2016）25-0017-03

山东省医药卫生科技发展计划项目（2014WS0217）。

白国立（1989-），在读研究生，主要研究方向为肝胆胰脾疾病。E-mail：bybaiguoli@163.com

简介：史光军（1966-），主任医师，博士，主要研究方向为肝胆胰脾疾病。E-mail：sgjzp@hotmail.com

2016-02-01）