应用间接炭粉凝集试验诊断猪副伤寒

陈兆龙

(黑龙江省萝北县畜牧兽医局,黑龙江萝北 154200)

应用间接炭粉凝集试验诊断猪副伤寒

陈兆龙

(黑龙江省萝北县畜牧兽医局,黑龙江萝北 154200)

间接炭粉凝集试验是以极细的炭粉(活性炭)为载体,将已知的猪霍乱沙门氏菌抗体吸附在炭粉的表面,制成抗体致敏炭粉,成为诊断未知猪副伤寒抗原的诊断液;反之,也可将已知的猪霍乱沙门氏菌悬液(抗原)吸附在炭粉的表面,制成抗原致敏炭粉,成为检查未知猪副伤寒抗体的诊断液。猪副伤寒炭粉诊断液与相应抗原(或抗体)相遇时,在电解质的参与下,二者发生特异性结合,使形成肉眼可见的炭粉凝集块,液体变得清亮透明,即为阳性反应;如果二者不相应,炭粉则聚集于液滴的中央,成为一个摇而不散的炭粉团,即为阴性。

副伤寒;猪;试验诊断

1 试验器材

96孔V型血清反应板1块，刻度吸管数支，微量混合器1台，台式离心机1台。

2 试验试剂

（1）活性炭。商品活性炭的颗粒大小不匀，多数呈不规则的针状。而致敏用的炭粉粒度要求在0.125～0.15mm之间。

（2）猪霍乱沙门氏菌高免疫血清。以仔猪副伤寒C500强度免疫家兔制成，效价不低于1：5600。以pH 6.4 PBS稀释成1：400倍，56℃ 30min灭活后，置4℃冰箱内保存备用。

（3）稀释液。pH6.4 PBS液98ml，加硼酸1.0g，加正常兔血清1.0ml，56℃30min灭活。

（4）pH6.4磷酸缓冲（PBS）液。

（5）猪副伤寒抗体致敏炭粉诊断液。取上述湿炭粉0.25g，加猪霍乱沙门氏菌高免疫血清（1：400）3.0ml，混匀后于37℃水浴中致敏10min，其间不断振摇，取出后以3000转/min离心10min，弃去上清液。按同样方法洗涤2次后，往沉淀物中加1%正常兔血清5.0ml，摇匀，以3000转/min离心10min，弃去上清液。最后向沉淀物中加1%正常兔血清3.0m，1%硫柳汞溶液0.03ml，充分混匀后即成猪副伤寒抗体致敏炭粉诊断液。

猪副伤寒抗体致敏炭粉诊断液的鉴定：在96孔V型血清反应板的第1、2孔内分别加入相应菌悬液0.1ml；第3孔加稀释液0.1ml，作对照。更换刻度吸管向第1、3孔中滴加猪副伤寒抗体致敏炭粉诊断液0.1ml；第2孔中滴加稀释液0.1m，充分振荡3分钟，至见不到炭粒沉淀为止。放置于湿盒内，静止5～7min，取出观察结果。如第1孔出现明显凝集，第2、3孔不出现凝集，则制备的猪副伤寒抗体致敏炭粉诊断液为合格；如第1孔不出现明显凝集，为不合格，应重作。

（6）猪副伤寒抗原致敏炭粉诊断液。①洗涤抗原：将猪副伤寒沙门氏菌培养物用无菌生理盐水制成悬液，加入0.2%福尔马林杀菌。以3000～5000转/min离心沉淀30min集菌。沉淀菌以生理盐水洗涤2次，并用生理盐水制成2%菌悬液。②抗原击碎：将2%菌悬液置小三角瓶内，放入超声波清水槽内击碎15min（输出功率250W，水深3cm，频率320～340mA），采样放显微镜下检查有无完整菌体，如有未击碎菌体，可继续击碎5min。全部击碎后，以1000转/min离心5min，收集上层液体，即为抗原液，弃去沉淀。③猪副伤寒抗原致敏炭粉：取上述湿炭粉0.25g，加抗原液4.0ml，于20℃以上条件下，在超声波清水槽内作用15min（条件与抗原击碎时相同）。取出后以3000转/min离心5min（上层液可作为抗原回收）。沉淀物加正常兔血清0.25ml，充分振荡，使自凝炭粉分散，再加稀释液10ml，充分混匀后，以3000转/min离心10min。沉淀物再以稀释液洗涤3次。最后，将沉淀物悬浮于2.0ml稀释液中，即为猪副伤寒抗原致敏炭粉诊断液。④猪副伤寒抗原致敏炭粉诊断液的鉴定：取猪霍乱沙门氏菌高免疫血清在96孔V型血清反应板，用稀释液作倍比稀释，最后1孔为稀释液作对照。每孔中各加猪副伤寒抗原致敏炭粉诊断液1白金耳，轻轻混匀至见不到炭粒沉淀为止。放置于湿盒内，静止5～7分钟，取出观察结果。如在免疫血清稀释至含有1：200～1：400滴度，出现“＋＋”凝集者为合格，例如1：12800滴度免疫血清稀释至32～64倍时能出现“＋＋”凝集者。

（7）正常炭粉。用以56℃30分钟灭活后的正常家兔血清代替猪霍乱沙门氏菌高免疫血清，按上法处理炭粉即可。

（8）待检测抗原。以血液琼脂或麦康凯琼脂从病猪肝、脾或肺分离猪霍乱沙门氏菌。将培养物用无菌生理盐水制成猪霍乱沙门氏菌悬液，以3000～5000转/min离心沉淀30min集菌。沉淀菌以生理盐水做成1：50猪霍乱沙门氏菌悬液，供试验用。如为猪的脏器标本，可以乳钵研碎后，加入1：10～1：20生理盐水做成混悬液，以脱脂棉过滤，取过滤液，供检验用。

3 试验方法

试验方法有玻板凝集法和反应板凝集法两种。现以反应板凝集法为例介绍如下。

（1）血清反应板的第1、2孔滴加待检抗原液0.1ml；更换刻度吸管，向第3、4孔，分别各加生理盐水0.1ml。

（2）更换刻度吸管，向血清反应板的第1、2、3孔分别各滴加猪副伤寒抗体致敏炭粉诊断液0.1ml；更换刻度吸管，向第4孔滴加正常炭粉0.1ml；置微量混合器上（或手持旋转）混合3min，使猪副伤寒抗体致敏炭粉均匀分散于液体中，置湿盒内，室温下反应5min后观察结果。

4 判定标准

“＋＋＋＋”：100%凝集。炭粉在数秒钟迅速凝聚，液体透明。“＋＋＋”：75%凝集。大部分炭粉呈微粒凝聚，液体基本透明。“＋＋”：50%凝集。一半的炭粉凝集，其余的炭粒团聚呈较大的球形，摇而不散，液体呈半透明状。“＋”：25%凝集。炭粉很少凝集，液体呈不透明状。振荡时，胶粘的炭粉牢固团聚在一起。“－”：无凝集。炭粉颗粒均匀分布于液体中不发生凝集，液体呈均匀混浊的不透明状。振荡后没有凝聚的细小炭粒聚集于液滴中央。以“＋＋”为判定终点。如第2～4孔均呈现为阴性；第1孔呈现“＋＋”以上者（包括“＋＋”），被检样品为阳性。如第1孔呈现“＋”为可疑；呈“－”为阴性。

[1] 周利岳.猪副伤寒的诊治[J].畜禽业，2009，（9）：82.