纳米炭粉对土壤微生物活性的影响

张 晶，杜 威，赵翊明，和文祥,2

(1 西北农林科技大学 资源环境学院，陕西 杨凌 712100；2 农业部 西北植物营养与农业环境重点实验室，陕西 杨凌 712100)

纳米炭粉对土壤微生物活性的影响

张 晶1，杜 威1，赵翊明1，和文祥1,2

(1 西北农林科技大学 资源环境学院，陕西 杨凌 712100；2 农业部 西北植物营养与农业环境重点实验室，陕西 杨凌 712100)

【目的】 研究纳米炭粉对土壤脱氢酶活性和微生物量碳含量的影响。【方法】 采用室内模拟方法，研究了不同纳米炭粉添加量(0.00，1.00，3.00，5.00，10.00，20.00 g/kg)下土壤脱氢酶活性和微生物碳的变化，并分析了不同质量浓度纳米炭粉(0.0，1.0，3.0，4.5，7.5，15.0，30.0 g/L)对脱氢酶酶促反应产物——甲臜的吸附作用，以探明是否可用TTC法检测脱氢酶活性。【结果】 与未添加纳米炭粉处理相比，添加纳米炭粉后土壤脱氢酶活性降低，土壤微生物量碳含量总体略有增加，并保持在一个稳定的水平，表明纳米炭粉对微生物有微弱的激活作用。吸附试验结果表明，由于纳米炭粉具有较高的吸附性能，其加入后会很快吸附甲臜，导致产物量过低，呈现出土壤脱氢酶活性被抑制的假象。【结论】 纳米炭粉可激活土壤微生物活性，采用TTC法分析纳米炭粉土壤脱氢酶效应的结果并不可靠，需寻找更加完善的方法。

土壤脱氢酶；微生物量碳；纳米炭粉；TTC法

纳米材料和碳材料同为材料领域的研究热点，将二者结合制备的碳纳米材料具有特殊的结构和性能，近年来对其中的碳纳米管和富勒烯研究较多。研究表明，一方面由于处于纳米尺度，碳纳米材料能够进入细胞，可直接对动植物和人体造成损伤[1]，因此具有环境毒性；另一方面，由于具有较强的吸附能力，碳纳米材料会富集环境中的污染物，导致污染物的迁移、转化和归趋等环境行为发生改变，从而表现出污染修复作用。方惠会等[2]指出，未纯化的碳纳米管黏附有大量碳纳米颗粒，研究这些颗粒的结构与性质对碳纳米材料的应用具有重要意义。纳米炭粉作为碳纳米颗粒的一种，属于新型轻质纳米级无定型炭素材料[3]，目前已被广泛应用于信息、生物、农业、环境保护等诸多方面[4-5]。

土壤酶是陆地生态系统物质循环和能量流动中最活跃的生物活性物质[6]。脱氢酶是其中的主要酶类之一，其与微生物量碳常被用作反映土壤微生物活性的重要指标[7-8]。脱氢酶活性测定方法较多[9]，且基本都是在样品中加入人工受氢体，在酶作用下发生脱氢反应，人工受氢体接受氢原子被还原发生颜色改变，从而检测酶活性；人工受氢体有亚甲基蓝[10-11]、刃天青[12]、三苯基四氮唑氯化物(TTC)[13-14]以及氯化碘硝基四氮唑(INT)[15]等，最常用的则是TTC。

纳米炭粉的大量使用必然会影响土壤环境，因此开展其土壤效应研究，在理论和实践上具有重要意义。但目前对其土壤环境和土壤酶效应的报道较少。为此，本研究拟采用室内模拟方法，探讨纳米炭粉作用下土壤脱氢酶活性及微生物量碳的变化，以了解二者之间的关系，为更好地开展纳米炭粉的生态毒理效应及环境保护研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

纳米炭粉购自南京埃普瑞纳米材料有限公司，基本性质为：平均粒径30 nm，纯度99.9%，晶型为不规则的类球形，起始氧化温度800 K(空气中)，BET表面积120 m2/g，密度3.02～3.30 g/cm3。纳米炭粉扫描电镜(HITACHI S-4800 SEM)分析结果见图1。

图1 纳米炭粉的扫描电镜结果
Fig.1 SEM image of nano carbon powders

2个供试土壤均是采自陕西杨凌农田的土娄土。采样时，先去除表层(0～5 cm)土样，然后采集5～20 cm土层土样，将其风干，过孔径1 mm筛后备用。供试土壤理化性质见表1。

1.2 方 法

1.2.1 土壤活化 称取2 000 g风干土样，放入塑料盆中，均匀加入蒸馏水，使土壤水分含量达最大田间持水量的60%，然后放入恒温培养箱， 28 ℃避光通气培养7 d[16]。

1.2.2 酶效应研究 向300 g活化土壤中，加入不同含量(0.00(对照)，1.00，3.00，5.00，10.00，20.00 g/kg)纳米炭粉，混匀，密封28 ℃避光培养，分别在培养第1，3，5，7，15，30天时取样，用TTC法[15]测定土壤脱氢酶活性，酶活性以1 h 内单位质量土样(g) 产生的甲臜(TPF)量(g) 表示；同时在第1，30天采用氯仿熏蒸TOC法[17]测定土壤微生物量碳含量。每处理3个重复。

1.2.3 吸附试验 向30 g 1号风干土样中加入600 mg/kg葡萄糖[18]，调节含水量为最大田间持水量的60%，添加TTC溶液后恒温培养24 h，加入100 mL甲醇溶液，振荡20 min后，4 000 r/min离心5 min提取滤液，获得甲臜母液；同时超声(45 Hz、300 W)30 min制备不同质量浓度(0.0，1.0，3.0，4.5，7.5，15.0，30.0 g/L)的纳米炭粉胶体溶液，取2 mL不同质量浓度纳米炭粉胶体溶液，分别加入10 mL甲臜母液，振荡后离心，吸取上清液，在485 nm波长比色，测定溶液中剩余甲臜的含量。

1.3 数据处理

采用 Excel 2007和SPSS 18.0对试验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 纳米炭粉对土壤脱氢酶活性的影响

脱氢酶主要存在于活细胞中，作为氧化还原反应中氢的中间传递体，可以表征微生物整体活性。纳米炭粉对供试土壤脱氢酶活性的影响见表2。

注：同行数据后标不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters in each row mean significant difference atP<0.05.

从表2可以看出：在未加纳米炭粉的处理中，除第3天外，其余培养时间下1号土样脱氢酶活性均明显大于2号土样。培养第5天时，1号与2号土样脱氢酶活性差异最大。这与前人的研究结果[19]一致，主要是1号土样有机质等含量较高所致。添加纳米炭粉后，土壤脱氢酶活性均小于对照组处理，表明纳米炭粉抑制了土壤脱氢酶活性。随纳米炭粉添加量的增加，脱氢酶活性急剧减小。培养第3天，2号和1号土样分别在纳米炭粉添加量为3.00和5.00 g/kg时，土壤脱氢酶活性几乎检测不到。可见添加纳米炭粉后，有机质含量较低的2号土样对其更敏感。随培养时间的延长，低含量纳米炭粉处理土壤脱氢酶活性表现出先减小后增加的趋势，其中2号土样脱氢酶活性变化幅度小于1号土样。培养第30天，当纳米炭粉含量大于5.00 g/kg时供试土壤脱氢酶活性便无法检出。

2.2 纳米炭粉对土壤微生物量碳含量的影响

微生物量碳是评价土壤微生物数量和活性的重要指标[20]。此外，其能快速地响应土壤理化性质的变化，并且直接参与了土壤生物化学转化过程；也是土壤中植物有效养分的储备库，能促进土壤养分的有效化，因此在土壤肥力和植物营养中具有重要的作用。

由表3可以看出：当培养时间相同时，无论添加纳米炭粉与否，1号土样的微生物量碳含量均大于2号土样，这与1号土样的有机质及养分含量较高有关。加入纳米炭粉后，1号和2号土样土壤微生物量碳含量均呈现波动性变化趋势。如1号土样在第1天时除纳米炭粉添加量为20.00 g/kg处理与对照无显著差异外，其他纳米炭粉处理均显著大于对照；而培养第30天时除纳米炭粉添加量为1.00 g/kg处理显著大于对照组外，其余纳米炭粉处理土壤微生物量碳含量均小于对照，且随着添加量的增加而减小。表明纳米炭粉作用初期对土壤微生物具有明显的激活作用，这主要是由于纳米炭粉具有一些特殊的性质，可以提升土壤的保护容量，最终增加了土壤微生物活性。随着纳米炭粉添加量的增加，土壤微生物量碳含量均呈现先增加后降低的趋势。随培养时间延长，除土样2中的对照组外，其余纳米炭粉处理第30天的微生物量碳含量均小于第1天。

注：同列数据后标不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters in each column mean significant difference atP<0.05.

2.3 纳米炭粉对甲臜的吸附试验

由以上分析可看出，纳米炭粉导致脱氢酶活性急剧降低，表现出了较强的抑制作用；而微生物量碳含量总体则呈现出增加的趋势。究其原因：一个可能是脱氢酶活性直接受到了抑制，另一个可能是脱氢酶活性测定方法受到了纳米炭粉的干扰。为了验证上述2种可能，本研究进行了脱氢酶酶促反应产物——甲臜与纳米炭粉的吸附试验。

不同质量浓度纳米炭粉对甲臜的吸附结果见图2。从图2可以看出，随纳米炭粉质量浓度的增大，溶液中甲臜的含量逐渐减小，当纳米炭粉质量浓度达到1.0，3.0 g/L时，甲臜含量分别为对照的 93.70% 和82.25%，降幅较小；当纳米炭粉质量浓度达到15.0和30.0 g/L时，甲臜含量急剧减小，仅为对照的8.34%和0%。对溶液中甲臜含量(Y)与纳米炭粉质量浓度(C)进行拟合，结果为：Y=19.35-1.181×C，R2=0.999 5，表明纳米炭粉强烈吸附了甲臜，揭示出采用TTC法测定土壤脱氢酶活性时，如果有纳米炭粉等材料存在，将会使结果出现较大的偏差，导致结果偏低，无法反映土壤的真实变化情况。据此可知，测定添加纳米炭粉后土壤脱氢酶活性降幅较大的主要原因是纳米炭粉的吸附作用。

目前，仅少数人指出在测试中纳米材料本身对试验方法有一定影响，而小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应、宏观量子隧道效应和介电限域效应都是纳米微粒和纳米固体的基本特征，这一系列效应导致纳米材料在许多物理和化学方面都显示出特殊的性能，势必会对一些传统的试验测定方法产生一定的影响。然而，在众多的国内外文献资料中，仅2006 年Wörle-Knirsch等[21]明确指出，采用不同方法比较单壁碳纳米管对人上皮细胞的毒性时，出现了很多错误的假阳性结果。所以本试验中脱氢酶活性降低，是由于在纳米炭粉存在条件下，土壤脱氢酶酶促反应产物被吸附而导致的假抑制现象。所以TTC法并不适合测定纳米炭粉存在下的土壤脱氢酶活性研究。

图2 不同质量浓度纳米炭粉对甲臜的吸附作用
Fig.2 Adsorption of TPF by nano carbon powders with different concentrations

3 讨 论

综上所述，由于纳米炭粉具有特殊的理化性质，在进入土壤后，其对土壤中的微生物量碳含量影响较小，土壤微生物量碳含量略有增加；但在利用TTC法测定土壤脱氢酶活性变化时，由于碳纳米颗粒有较强的吸附作用，导致土壤脱氢酶活性降低，上述2种结果是因为纳米炭粉强烈地吸附了脱氢酶酶促反应的产物——甲臜所致。故在研究碳纳米颗粒环境效应时，采用TTC法进行脱氢酶研究是不适用的。

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Effects of nano carbon powder on activity of soil microorganism

ZHANG Jing1,DU Wei1,ZHAO Yi-ming1,HE Wen-xiang1，2

(1CollegeofResourceandEnvironment,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;2KeyLaboratoryofPlantNutritionandtheAgri-environmentinNorthwestChina,MinistryofAgriculture,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study aimed to research the influence of nano carbon powder on soil dehydrogenase activity and microbial biomass carbon content.【Method】 Using indoor simulation,the changes of soil dehydrogenase activity and microbial carbon content were investigated by adding different amounts (0.00,1.00,3.00,5.00,10.00,and 20.00 g/kg) of nano carbon powder.The adsorption of TPF by nano carbon powders with different concentrations (0.0,1.0,3.0,4.5,7.5,15.0,and 30.0 g/L) was also analyzed to test whether TTC method was useful to detect dehydrogenase activity.【Result】 Compared with the CK,nano carbon powder decreased soil dehydrogenase activity and increased content of carbon in soil microorganism slightly to a stable level,indicating that nano carbon powder had weak activation effect on microorganism.The adsorption test showed that nano carbon powder had high adsorption performance,which quickly adsorbed TPF,caused low yield,and showed false inhibiting appearance of soil dehydrogenase activity.【Conclusion】 Nano carbon powder activated soil microbial activity.Using TTC method to analyze soil dehydrogenase with nano carbon powder was not reliable and future work is needed to find better method.

soil dehydrogenase;microorganism carbon;nano carbon powder;TTC

2013-12-27

国家高技术研究发展计划项目(2012AA101402)；西北农林科技大学基本科研业务费科研创新重点项目(ZD2013012)；西北农林科技大学大学生科技创新项目

张 晶(1989-)，女，陕西西安人，硕士，主要从事环境微生物研究。E-mail：greenwind1989@163.com

和文祥(1968-)，男，陕西黄龙人，教授，博士，博士生导师，主要从事土壤生态毒理及土壤生物化学研究。 E-mail：wenxianghe@nwsuaf.edu.cn

时间:2015-05-11 15:03

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.016

S154.2

A

1671-9387(2015)06-0162-05

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150511.1503.016.html