日粮钙水平对仔猪成骨细胞活性和胫骨性能的影响

邹 磊，冀红芹，刘禹含，孙 会，秦贵信

(吉林农业大学 动物科技学院，动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，吉林省动物营养与饲料科学重点实验室，吉林 长春 130118)

日粮钙水平对仔猪成骨细胞活性和胫骨性能的影响

邹 磊，冀红芹，刘禹含，孙 会，秦贵信

(吉林农业大学 动物科技学院，动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，吉林省动物营养与饲料科学重点实验室，吉林 长春 130118)

【目的】 研究日粮钙水平对仔猪血清碱性磷酸酶活性、骨钙素质量浓度、血清钙浓度及胫骨钙含量和密度的影响，为钙调控仔猪成骨细胞活性提供依据。【方法】 采用单因子完全随机分组设计，将60头杜长大仔猪(体质量(21.8±2.1) kg)分成6个处理，每处理设10个重复，每重复1头猪。各处理分别饲喂钙水平为0.30%，0.45%，0.60%，0.75%，0.90%和1.05%的玉米-豆粕型日粮。预饲期为7 d，正式试验期28 d，并在正式试验的14和28 d屠宰仔猪，测定其血清钙浓度、血清活性标志物碱性磷酸酶活性和骨钙素质量浓度及胫骨钙含量和密度，分析钙水平对仔猪成骨细胞活性和胫骨性能的影响。【结果】 随着日粮钙水平的提高，血清碱性磷酸酶活性呈先减小后增大的趋势(P<0.05)，且在日粮钙水平为0.75%时出现最小值；血清骨钙素质量浓度呈先增大后减小的趋势(P<0.05)，且在钙水平为0.75%时达到最大(P<0.05)；日粮钙水平对血清钙浓度无显著影响(P>0.05)，但对胫骨钙含量、脱脂胫骨干质量、胫骨灰分含量、胫骨密度4项胫骨性能指标影响显著(P<0.05)，且在日粮钙水平为0.75%时，各项胫骨性能指标均达到最大。【结论】 日粮钙水平为0.75%时，仔猪胫骨中成骨细胞的矿化作用最大，增殖活性最小。

仔猪；日粮钙水平；成骨细胞活性；血清钙；胫骨性能

钙是动物生长所必需的矿物质营养元素。在动物体内，钙能调节肌肉和神经的兴奋性，维持体液的酸碱平衡等，更重要的是其参与着动物骨骼的新陈代谢过程。大量研究表明，钙水平的不同会影响动物的骨骼性能和血液生化指标[1-2]，因此钙是配制猪日粮时应考虑的重要因素之一[3]。作为动物骨形成作用及骨重建作用的主要功能性细胞，成骨细胞本身可合成、分泌多种生长因子，并以自分泌的方式调节自身的代谢、增殖和分化，其中成骨细胞自身分泌的碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)和骨钙素(Osteocalcin，OCN)是评价成骨细胞活性的重要指标。本试验研究了在日粮中添加不同剂量钙对仔猪血清ALP活性、OCN质量浓度和血清钙浓度及胫骨性能的影响，旨在为钙调控仔猪成骨细胞的活性研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验采用单因子随机分组设计。将60只健康状况良好的杜长大仔猪按平均体质量(21.8±2.1) kg随机分为6个处理，每处理10个重复，单圈饲养。6个处理分别饲喂钙水平为0.30%,0.45%,0.60%,0.75%,0.90%,1.05%的试验日粮，各日粮的配方组成见表1。试验时间35 d，前7 d为预饲期，后28 d为正式试验期。试验在吉林农业大学养殖基地进行，试验期间仔猪自由采食，鸭嘴式饮水器自由饮水，按常规的免疫程序免疫。喂料量以仔猪吃饱后略有剩余为准，记录采食量。各组的试验条件均保持一致。

1.2 试验日粮

试验日粮以玉米和豆粕为主要原料，按照美国NRC猪营养需要(1998版)配制。除钙含量不同外，日粮中其他营养成分均满足仔猪的营养需要。不同钙水平试验日粮的营养指标如表2所示。

注：1) 预混料为每千克日粮提供：VA5 000 IU，VD1 000 IU，VE10 mg，VK32 mg，VB11 mg，VB22 mg，VB120.01 mg，叶酸0.1 mg，CuSO4·5H2O 30.4 mg，FeSO4·7H2O 580 mg，ZnSO4·7H2O 512 mg，MnSO4·H2O 11.9 mg，KI 0.36 mg，Na2SeO31.1 mg; 2)营养水平均为计算值。

Note:1)The premix provides the following per kg diet：VA5 000 IU，VD1 000 IU，VE10 mg，VK32 mg，VB11 mg，VB22 mg，VB120.01 mg，Folic acid 0.1 mg，CuSO4·5H2O 30.4 mg，FeSO4·7H2O 580 mg，ZnSO4·7H2O 512 mg，MnSO4·H2O 11.9 mg，KI 0.36 mg,and Na2SeO31.1 mg; 2) Nutrient levels are calculated values.

1.3 样品采集

分别于正式试验期的第14和28天，每组随机选取3只猪，静脉采血20 mL于非抗凝采血管中， 4 ℃下3 000 r/min离心15 min制备血清，-20 ℃冷冻保存备用。采血后，按照标准屠宰工艺进行屠宰，迅速摘取右侧胫骨，剔除胫骨上附着的肌肉及筋膜等组织,称质量后分装在提前准备好的自封袋中，于-20 ℃冰柜保存备用。屠宰结束后，参照陈艳君[4]的脱脂方法，对胫骨样品进行脱脂，制备成风干样于4 ℃保存备用。

1.4 测定项目及方法

1.4.1 血清钙浓度 采用邻甲酚酞络合酮比色法测定血清钙浓度[5]，使用罗氏P800全自动生化分析仪进行测定。

1.4.2 血清成骨细胞活性标志物 血清中的ALP的活性和骨钙素质量浓度，分别采用碱性磷酸酶酶联免疫试剂盒和骨钙素酶联免疫试剂盒进行检测。

1.4.3 骨钙含量 骨钙含量采用原子吸收分光光度法测定[5]，所用仪器为AA-800型原子吸收分光光度计(美国PE)，测定结果为风干基础。

1.4.4 脱脂骨干质量 将所有骨样置于70 ℃烘箱中烘72 h，然后将骨样从中间折为2截，分别用脱脂纱布包扎，贴签，并置于无水乙醚中连续浸泡，无水乙醚每天更换1次，1周后取出，待乙醚挥发彻底后，将脱脂骨样在105 ℃烘箱中烘6 h后称质量，即得脱脂骨干质量[5]。

1.4.5 胫骨灰分含量 胫骨灰分参照张丽英等[6]的方法进行测定，在茂福炉中的灰化时间为36 h。

1.4.6 胫骨密度(BMD) 在长春中日联谊医院采用双能X线骨密度仪(法国)进行测定。将自然解冻至室温(20 ℃左右)的胫骨置于探测器下，选前端和1/2处为测定点，启动装置，测定仪自动测定并计算胫骨密度(BMD)。

1.5 试验数据处理

试验数据利用SPSS 17.0软件进行方差分析，并进行Duncan氏多重比较，统计显著性水平为P<0.05。各组试验数据均以“平均值±标准差(Means±SD)”表示。

2 结果与分析

2.1 日粮钙水平对仔猪血清钙浓度和成骨细胞活性标志物的影响

由表3可以看出，日粮钙水平对14和28 d屠宰仔猪血清碱性磷酸酶(ALP)活性有显著影响(P<0.05)，随日粮钙水平的提高，14和28 d仔猪血清ALP活性均呈现出先减小后增大的趋势，且均以日粮钙水平为0.75%时的血清ALP活性显著低于0.30%和1.05%钙水平(P<0.05)，14与28 d屠宰仔猪血清中的ALP活性在钙水平为0.45%和0.90%时差异不显著(P>0.05)，其余钙水平之间均有一定差异(P<0.05)。当日粮钙水平由0.30%升高到1.05%时，14和28 d屠宰仔猪血清中的骨钙素(OCN)质量浓度均呈先增高后降低的趋势，且均以日粮钙水平为0.75%时的血清OCN质量浓度最高，并显著高于其他钙水平(P<0.05)；不同钙水平之间相比，14 d屠宰仔猪血清OCN质量浓度的差异均达显著水平(P<0.05)，28 d屠宰仔猪血清的OCN质量浓度除0.45%与0.60%及0.30%与0.90%钙水平间差异不显著(P>0.05)外，其余钙水平间均有显著差异(P<0.05)；在钙水平为0.30%时，14与28 d屠宰仔猪血清中的OCN质量浓度差异不显著(P>0.05)，而在其余钙水平之间均差异显著(P<0.05)。日粮钙水平及饲喂时间对仔猪血清钙浓度影响均不显著(P>0.05)。

注：同列数据后小写字母相同者表示差异不显著(P>0.05)，小写字母不同者表示差异显著(P<0.05)；同行数据后大写字母相同者表示差异不显著(P>0.05)，大写字母不同者表示差异显著(P<0.05)，下表同。

Note:Same lowercase letters in each column indicate insignificant difference (P>0.05),while different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).Same uppercase letters in each row indicate insignificant difference (P>0.05),while different uppercase letters indicate significant difference (P<0.05).The same below.

综合来看，随着日粮钙水平的增大，仔猪血清中的ALP活性呈先减小后增大趋势，且在日粮钙水平为0.75%时最小，血清仔猪OCN质量浓度在日粮钙水平为0.75%时达到最大。

2.2 日粮钙水平对仔猪胫骨性能的影响

由表4可以看出，本试验条件下，日粮钙水平对试验仔猪胫骨各项性能指标均有显著影响(P<0.05)。14和28 d仔猪胫骨钙含量均随着日粮钙水平的上升呈现出先升高后降低的趋势，均在日粮钙水平为0.75%时出现最高值，且28 d仔猪的胫骨钙含量均高于14 d (P<0.05)。脱脂胫骨干质量随着日粮钙水平的升高呈先升高后降低趋势，在钙水平为0.75%达到最高，28 d仔猪脱脂胫骨干质量的变化趋势与14 d时保持一致，但大于14 d的脱脂胫骨干质量(P>0.05)。仔猪胫骨灰分以0.60%～1.05% 4个钙水平下的含量显著较0.30%和0.45%钙水平时高(P<0.05)，0.75%钙水平下的仔猪胫骨灰分含量最大(P<0.05)，0.60%，0.90%与1.05%钙水平之间差异不显著(P>0.05)。14d时，日粮钙水平对试验仔猪胫骨前端处密度影响不显著(P>0.05)，但试验仔猪胫骨前端处密度随日粮钙水平的升高呈先升高后降低的趋势，在日粮钙水平为0.75%时出现最高值；0.75%钙水平时仔猪胫骨1/2处密度显著高于0.30%钙水平(P<0.05)，但各钙水平之间差异不显著(P>0.05)。28 d时，日粮钙水平对仔猪胫骨前端处密度和胫骨1/2处密度影响显著(P<0.05)，其变化趋势与14 d时一致。当日粮钙水平为0.30%时，14和28 d的胫骨钙含量和脱脂胫骨干质量差异显著(P<0.05)，其他胫骨性能指标差异不显著(P>0.05)；当日粮钙水平为0.45%时，14和28 d的胫骨钙含量、脱脂胫骨干质量和胫骨1/2处密度差异显著(P<0.05)，其他胫骨性能指标均差异不显著(P>0.05)；当日粮钙水平为0.60%时，14和28 d仔猪的所有胫骨性能指标均差异显著(P<0.05)；当日粮钙水平为0.75%时，14和28 d仔猪胫骨灰分含量的差异不显著(P>0.05)，其他胫骨性能指标均差异显著(P<0.05)；当日粮钙水平为0.90%时，14和28 d仔猪的胫骨钙含量和胫骨灰分含量差异不显著(P>0.05)，其他胫骨性能指标差异显著(P<0.05)；日粮钙水平为1.05%时，14和28 d仔猪胫骨性能指标的表现与日粮钙水平0.90%时相同。

2.3 不同日粮钙水平下仔猪血清指标与胫骨性能的回归分析

在不同日粮钙水平条件下，以28 d时仔猪的胫骨钙含量、胫骨灰分含量、脱脂胫骨干质量和胫骨密度为因变量(Y)，以血清中的碱性磷酸酶活性和骨钙素质量浓度及血清钙浓度为自变量(x)建立回归方程，结果如表5所示。

由表5可见，在日粮不同钙水平条件下，血清ALP活性与5项胫骨性能指标均呈负相关关系(自变量系数为负)，且拟合程度较好，除血清ALP活性与胫骨1/2处密度的线性方程外，其他各方程的R2均大于或等于0.70；血清OCN质量浓度与5项胫骨性能指标均呈正相关关系(自变量系数为正)，且拟合程度非常好，其中血清OCN质量浓度与胫骨钙含量、胫骨灰分含量、脱脂胫骨干质量和胫骨前端密度线性方程的拟合程度均较好，R2均接近或大于0.90；血清钙浓度与5项胫骨性能指标均呈正相关关系(自变量系数为正)，且拟合程度较好，其中血清钙浓度与脱脂胫骨干质量线性方程的拟合程度最好(R2>0.90)。

3 讨 论

3.1 日粮钙水平对仔猪成骨细胞活性标志物的影响

ALP是在碱性环境中能水解磷酸脂产生磷酸的几种同工酶的统称，在动物体内广泛存在,血清中的ALP有50%来源于骨,其余50%主要来自肝脏和小肠。通过肝脏和小肠进入血中的ALP活性表现稳定，因此血清ALP活性的变化主要由是骨代谢引起的，所以血清的ALP活性可以间接反映成骨细胞的活动状况。又由于ALP主要是由分化的成骨细胞分泌，故常作为成骨细胞增殖分化的早期标志物，且当骨矿化、骨形成发生障碍时，ALP的分泌量会有所升高[7]。本试验结果表明，随着日粮钙水平的增加，仔猪血清中的ALP活性呈先减小后增大趋势，这与Eklou-Kalonji等[8]的研究结果一致。在本试验中，日粮钙水平为0.75%时仔猪血清中的ALP活性最低，这是由于当日粮钙水平为0.30%～0.75%时，动物机体摄入的钙水平表现不足，为了维持血钙的平衡，破骨细胞活性增强，动员骨钙入血，并使骨骼钙化受阻，进而刺激了成骨细胞的增殖分化，使其大量分泌ALP，这一过程符合生物学规律，而当日粮钙水平从0.75%提高到1.05%时，ALP活性升高，说明在此范围内，成骨细胞的增殖活性随着日粮钙水平的升高而升高。

成骨细胞成熟后，在其基质矿物化时期会分泌OCN。OCN是一种骨非胶原蛋白,占骨非胶原蛋白的 10%～20%[9]，其生理功能是保持骨的正常矿化,抑制由于异常的羟磷灰石结晶沉积所致的软骨矿化,促进骨基质成熟[10-11]。除分布在骨基质外，OCN还可以分泌入血[12]，所以OCN是成骨细胞成熟分化的标志[13]，可以反映成骨细胞的成骨性能，是评估骨转换及骨形成的特异性标志物[14]。本研究表明，随着日粮钙水平的升高，OCN质量浓度呈现出先增大后减小的趋势，且在日粮钙水平为0.75%时血清中的OCN质量浓度最高，而且胫骨钙含量和胫骨密度最大，说明在此日粮钙水平下，仔猪胫骨骨髓中的成骨细胞多数处于成熟期，其矿化作用明显。

3.2 日粮钙水平对仔猪胫骨性能的影响

由于机体代谢钙会优先满足骨钙沉积的需要，所以胫骨钙含量反映了骨钙的沉积量，也可反映成骨细胞骨形成作用的强弱，而胫骨密度更能反映动物的骨质量及骨代谢情况，胫骨灰分含量和胫骨脱脂干质量也是评价胫骨性能的常用指标。在本试验条件下，日粮钙水平低于0.75% 时，随着日粮钙水平的降低，仔猪各项胫骨性能指标皆随之降低，这说明缺钙可直接影响到仔猪骨骼的正常发育。大量试验结果表明，缺钙会严重影响动物骨骼的发育，使动物骨骼的钙含量、骨矿含量及密度降低，甚至使其空间结构发生改变[15-17]。本研究表明，当日粮钙水平高于 0.75% 时，仔猪胫骨钙含量、胫骨灰分含量、脱脂胫骨干质量和胫骨密度均随着钙水平的升高而降低，这与王晓宇等[5]、林映才等[18]的研究结果一致；李文立等[19]和王灿楠等[20]的研究也表明，日粮钙水平过高或过低均不利于仔猪骨钙的沉积。

3.3 日粮不同钙水平下各生化指标与胫骨性能指标的回归分析

线性回归方程可以反映日粮不同钙水平下各项血清指标与胫骨性能指标的关系，进而预测成骨细胞骨形成作用的强弱。本研究结果表明，作为一种可以使骨骼正常矿化和转换的蛋白质，血清中的OCN质量浓度与胫骨各项性能指标均呈显著正相关关系，说明在日粮不同钙水平下，胫骨性能随着OCN质量浓度的升高而增强。血清中的ALP活性与胫骨各项性能指标均呈负相关关系，表明在不同日粮钙水平下，随着ALP活性的升高，胫骨性能降低。有研究表明，血清钙浓度可以影响骨的形成[21]，新骨的形成需要血清钙的提高[22]。本试验结果显示，日粮不同钙水平对血清钙浓度影响不显著，但血清钙浓度随着日粮钙水平的升高呈先升高后降低的趋势，并与胫骨各项性能指标(P<0.05)呈显著的正相关关系。

4 结 论

仔猪血清中的ALP活性与胫骨各项性能指标呈显著负相关关系,OCN质量浓度和血清钙浓度与胫骨各项性能指标呈显著正相关关系,且在日粮钙水平为0.75%时，仔猪血清中的ALP活性最低，OCN质量浓度最高，胫骨各项性能最佳，说明此时成骨细胞增殖活性最小,矿化作用达到最大。

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Effects of dietary calcium level on osteoblast activity and tibia performance of piglets

ZOU Lei,JI Hong-qin,LIU Yu-han,SUN Hui,QIN Gui-xin

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,KeyLabofAnimalProductionandSafetyofMinistryofEducation,JilinKeyLabofAnimalNutritionandFeedScience,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

【Objective】 The effects of different calcium levels on calcium content in bones,serum alkaline phosphatase concentration,serum osteocalcin concentration,serum calcium concentration,calcium content in tibia and BMD of tibia of piglets were investigated to provide theoretical basis for using calcium levels in dietary to adjust osteoblast activity of piglets.【Method】 The completely randomized design was adopted and a total of 60 experimental piglets with similar body weights (21.8±2.1) kg were randomly allotted into 6 treatments with 10 repetitions in each treatment and one pig was a repetition.Piglets were fed diets with six different calcium levels (0.30%,0.45%,0.60%,0.75%,0.90% and 1.05%) randomly in a single factorial arrangement.The preparation trial period was 7 d,and the trial period was 28 d.The serum alkaline phosphatase concentration,serum osteocalcin concentration,serum calcium concentration and tibia performance were measured at d14 and d28 to investigate the effects of calcium level on ossification of osteoblasts and tibia performance.【Result】 Alkaline phosphatase concentration in serum decreased at first and increased subsequently with the increase of dietary calcium level,and the lowest value was observed in 0.75% group (P<0.05).Osteocalcin concentration in serum was contrary to alkaline phosphatase,and it reached the peak in 0.75% group (P<0.05).Calcium content in serum of piglets had no significant difference with the increase of dietary calcium (P>0.05),but the effects on calcium content of tibia,dry weight of defatted tibia,ash content in defatted tibia and BMD of tibia were significant (P<0.05) withthe highest values in 0.75% group (P<0.05). 【Conclusion】 When the calcium level was 0.75%,ossification of osteoblasts in tibia was the greatest and the activity was the minimum.

piglets;calcium level of diet;osteoblast activity;serum calcium concentration;tibia performance

2013-12-09

国家公益性行业(农业)科研专项(200903006)

邹 磊(1986-)，男，吉林长春人，硕士，主要从事肉猪营养与饲料研究。E-mail:zoulei2011@sina.com

孙 会(1962-)，男，吉林省吉林市人，教授，博士，硕士生导师，主要从事肉猪营养与饲料研究。 E-mail:hui1688@163.com

时间:2015-05-11 15:02

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.002

S828.4+1

A

1671-9387(2015)06-0021-07

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150511.1502.002.html