转染人TBX18基因的大鼠心脏成纤维细胞中HCN4蛋白表达、If及对心肌细胞搏动频率的影响观察

权大君,曹政,杨媚,李莎

(1武汉大学人民医院，武汉430060；2武汉大学心血管研究所；3湖北省心血管重点实验室；4十堰市太和医院)

转染人TBX18基因的大鼠心脏成纤维细胞中HCN4蛋白表达、If及对心肌细胞搏动频率的影响观察

权大君1,2,3,曹政4,杨媚1,2,3,李莎1,2,3

(1武汉大学人民医院，武汉430060；2武汉大学心血管研究所；3湖北省心血管重点实验室；4十堰市太和医院)

目的 观察转染人TBX18基因的大鼠心脏成纤维细胞HCN4蛋白表达、超极化激活内向离子电流(If)及对心肌细胞搏动频率的影响。方法 取新生SD大鼠，断头处死后取心脏，分离培养成纤维细胞及心肌细胞。构建人TBX18基因的腺病毒载体Ad-GFP-TBX18，包装并纯化病毒滴度至1×1010TU/mL。取传代2～5代时对数生长期新生大鼠成纤维细胞分为A、B、C组，培养24 h后 A、B组分别转染Ad-GFP-TBX18、腺病毒载体pHBAd-MCMV-GFP(阴性对照)，C组不做任何处理。采用RT-PCR法检测各组细胞TBX18 mRNA。采用Western blotting法检测各组超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4(HCN4)蛋白。采用电压钳记录各组细胞超极化激活内向离子电流(If)。将各组细胞与新生大鼠心肌细胞共培养，观察新生大鼠心肌细胞搏动频率。结果 A、B、C组TBX18 mRNA相对表达量分别为98.32±6.21、1.03±0.05、1.02±0.02。A组TBX18 mRNA相对表达量高于B、C组(P均<0.05)；B、C组TBX18 mRNA相对表达量差异无统计学意义。A、B、C组HCN4蛋白相对表达量分别为0.49±1.21、0.12±0.02 、0.09±0.01。A组HCN4蛋白相对表达量高于B、C组(P均<0.05)；B、C组HCN4蛋白相对表达量差异无统计学意义。A组约有30%的细胞可以检测到If，而B、C组中没有细胞检测到If。同一时点A组新生大鼠心肌细胞搏动频率高于B、C组(P均<0.05)；B、C组新生大鼠心肌细胞搏动频率差异无统计学意义。结论 转染人TBX18基因的大鼠心脏成纤维细胞高表达HCN4蛋白，存在If电流，并能促进共培养新生大鼠心肌细胞的搏动。

TBX18基因；基因转染；成纤维细胞；心肌细胞；超级化激活环核苷酸门控阳离子通道4；超极化激活内向离子电流；心脏起博；动物实验

近年来，缓慢性心律失常的发病率逐年升高。安装心脏起搏器可缓解症状，但起搏器不能随患者情绪变化、激烈运动情况做出自主调节，且有需定期更换电池、易受电磁波干扰及不适合儿童使用等缺点，因此寻找替代疗法生物起搏器逐渐成为了研究热点。最近，跨系重编程方法的出现使得一种细胞直接转变成另一种细胞成为可能，如成纤维细胞经不同转录因子修饰可转变成多功能干细胞[1]、神经细胞[2]、心肌细胞[3]、红系或粒系细胞[4]，为生物起搏器的研究提供了新的方向。有研究证实人类促生长转录因子TBX18可使心肌细胞直接重编程为类窦房结样细胞，增加细胞膜上超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(HCN4)的表达，从而提高其搏动频率，且在豚鼠[5]与猪[6]心脏上得到了证实，但是尚未见大鼠上的相关报道。在窦房结细胞和浦肯野细胞4期自动去极化中超极化激活内向离子电流(If)发挥着重要的作用，而HCN通道是产生If的特异性离子通道。本研究将人TBX18基因转染入新生大鼠成纤维细胞，观察转染后HCN4蛋白表达、If，并将其与大鼠心肌细胞共培养观察心肌细胞搏动频率。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂及仪器 出生1～3 d的SD大鼠10只，雌雄不等，由武汉大学实验动物中心提供。DMEM/F12(1∶1)培养液(Gibco)，胎牛血清(GIBCO)，胰蛋白酶(Sigma),Ⅱ型胶原酶(Sigma)，5-溴脱氧尿核苷(Sigma)；载体pHBAd-MCMV-GFP(Hanbio)，DH5 (Tiangen)，质粒DNA抽提试剂盒(康为世纪)，BamHⅠ酶，NotⅠ酶；超极化激活环核苷酸门控阳离子通道 4蛋白(HCN4)羊抗鼠(一抗，Abcam)；波形蛋白(Vimentin)羊抗兔(一抗，CST)。荧光显微镜(德国Leica公司，TCS SP2MP)，PCR仪(杭州博日科技)，电泳仪(北京市六一仪器厂)，扫描仪(Canon)。

1.2 新生大鼠成纤维细胞及心肌细胞的分离培养 取10只出生1～3 d的SD大鼠，断头处死后取心脏组织，0.125%胰蛋白酶37 ℃恒温消化10 min，弃上清液，加入组织体积4～5倍的0.08%胶原酶Ⅱ和0.125%胰酶的混合酶再次消化8～9次。取上清用含有10%FBS的低糖DMED终止消化，1 000 r/min离心10 min，用含有10%FBS的F12悬浮，用200目不锈钢筛网过滤所得全部细胞，后接种于10 cm培养皿中， 37 ℃、5%CO2的培养箱中差速贴壁90 min。贴壁细胞即为成纤维细胞，未贴壁细胞即为心肌细胞。取培养第2天的心肌细胞与传代第3代的成纤维细胞制作细胞爬片，免疫荧光实验鉴定细胞，荧光显微镜下，成纤维细胞Vimentin 抗原表达阳性细胞率为97%，心肌细胞α-actin抗原阳性细胞率90%。

1.3 Ad-GFP-TBX18腺病毒载体构建、包装及滴度测定 用BamHⅠ和NotⅠ酶对pHBAd-MCMV-GFP腺病毒载体(上海Hanbio公司)进行双酶切，同时用PCR扩增TBX18的开放阅读框，使酶切产物与TBX18片段连接，构建成Ad-GFP-TBX18腺病毒载体。重组载体进行PCR测序分析，结果显示插入片段序列正确。将Ad-GFP-TBX18腺病毒载体、Lipofectamine2000试剂与Opti-MEM 混合均匀后转染至293细胞，当细胞变大变圆呈葡萄状，出现明显噬斑时开始收毒，并于液氮及37 ℃水浴中反复冻融3次，离心、过滤收集病毒浓缩液，此时Ad-TBX18滴度为1×1010PFU/mL，并于-80 ℃保存，已备后续实验使用。

1.4 新生大鼠成纤维细胞成纤维细胞分组及基因转染 取传代2～5代时对数生长期新生大鼠成纤维细胞接种于到6孔板，5×105/孔。将细胞分为A、B、C组，每组6个复孔。细胞培养24 h后 A、B组分别转染Ad-GFP-TBX18、腺病毒载体pHBAd-MCMV-GFP(阴性对照)，C组为空白对照组，不做任何处理。72 h后在荧光显微镜下观察细胞，检测绿色荧光蛋白，挑选荧光强度大(代表转染效率高)的细胞扩大培养，用于后续实验。

1.5 各组细胞TBX18 mRNA检测 采用RT-PCR法检测上述各组细胞TBX18 mRNA。取各组对数生长期细胞，提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA并进行荧光定量PCR检测。所有操作均严格按照使用说明书进行。反应条件：95 ℃、1 min，95 ℃、15 s，58 ℃、20 s，72 ℃、45 s，退火60 ℃，每20 s升温1 ℃至95 ℃。TBX18上游引物5′-GGAGACTTGGATGAGACAAGTGAT-3′，下游引物5′-TTGGCAAATGGATTCCTGTCT-3′；以GAPDH作为内参，上游引物5′-CGCTAACATCAAATGGGGTG-3′，下游引物5′-TTGCTGACAATCTTGAGGGAG-3′)。采用2-ΔΔCt表示各组TBX18 mRNA相对表达量。

1.6 各组细胞HCN4蛋白检测 采用Western blotting法。转染72 h后取各组对数生长期细胞，TBS润洗2～3次，细胞裂解液混匀，冰浴30 min，获取上清液。BCA法提取总蛋白，取40 μg总蛋白，12%SDS-PAGE电泳，将蛋白质条带转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，TBST洗膜，分别加入HCN4一抗( 1∶500)/GAPDH(1∶10 000)，4 ℃过夜；TBST洗膜3次，5 min/次。二抗采用山羊抗兔-HRP / 兔抗大鼠-HRP (1∶10 000)室温避光孵育30 min，TBST摇床上洗4次，5 min/次。显影、曝光。以GADPH为内参，以Band-Scan软件进行灰度扫描并进行定量分析。各组HCN4蛋白相对表达量用HCN4蛋白条带灰度值和GAPDH条带灰度值之比表示。

1.7 各组细胞If检测 采用电压钳记录各组细胞If。采用EPC-9放大器和Pulse软件进行数据记录和分析。将对数生长期各组细胞置于灌流槽内,经细胞外液(含氯化钠 135 mmol/L、 氯化钾 5.4 mmol/L、氯化钙 1.8 mmol/L、 氯化镁 1 mmol/L、 氯化钡 2 mmol/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液10 mmol/L、葡萄糖 10 mmol/L，pH值为7.4)持续恒温灌流(2 mL/min)。电极阻抗2.5～5 MΩ并充灌细胞内液 (含K+-ATP 5 mmol/L、氯化钾120 mmol/L、氯化镁5 mmol/L、氯化钙1 mmol/L、乙二醇双2-氨基乙基醚四乙酸10 mmol/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液10 mmol/L，pH值为7.3)，串联电阻4～8 MΩ。分别于室温(22～25 ℃)和37 ℃条件下记录If，维持电位-30 mV，测试电位逐渐降至-110 mV，阶跃10 mV，钳制时间6 000 ms引出。利用100 μmol/L氯化钡去除IK1电流的干扰。

1.8 与各组细胞共培养的新生大鼠心肌细胞搏动频率观察 A、B组转染48 h后，用0.025%胰蛋白酶消化成细胞悬液，以1∶5的比例与对数生长期的乳鼠心肌细胞共培养，并于37 ℃、含有5%CO2的培养箱中培养，2 d换一次培养基。培养第2、4、6、8、10、12、14天在倒置显微镜下观察并记录各组共培养细胞的搏动频率。

2 结果

A、B、C组TBX18 mRNA相对表达量分别为B、C组的98.32±0.85、1.03±0.05、1.02±0.02。A组TBX18 mRNA相对表达量高于B、C组(P均 <0.05)；B、C组TBX18 mRNA相对表达量差异无统计学意义。A、B、C组HCN4蛋白相对表达量分别为0.49±1.21、0.12±0.02、0.09±0.01，A组HCN4蛋白相对表达量高于B、C组(P均<0.05)；B、C组HCN4蛋白相对表达量差异无统计学意义。A组约有30%的细胞可以检测到If，而B、C组中没有细胞检测到If。不同培养时间各组新生大鼠心肌细胞搏动频率比较见表1。同一时点A组新生大鼠心肌细胞搏动频率高于B、C组(P均<0.05)；B、C组新生大鼠心肌细胞搏动频率差异无统计学意义。

表1 不同培养时间各组新生大鼠心肌细胞搏动频率比较±s)

注：与A组比较，#P<0.05。

3 讨论

目前研究生物起搏的方法主要是通过干预最终使起搏细胞以外的其他细胞在保留自身表型的同时具有起搏细胞的特性和功能[5]。这些方法虽然可通过调节膜电位或使细胞去极化产生起搏电流，但存在电流不稳定、传导阻滞或没有自主调节等缺点。而最新研究发现不管在体外还是体内心肌细胞转染TBX18基因后其表型与功能都向窦房结样细胞转变[6，7]。 TBX18是一种转录因子，主要负责胚胎向成熟心脏发育时窦房结头部的形成，小鼠敲除TBX18基因后其窦房结发育较小但其功能变化不明显[8]。乳鼠心肌转染TBX18后可使其Cox43表达下降、因内向整流钾通道表达减少从而提高其最大舒张电位、还可提高HCN4的表达且提高自发起搏频率。还可提高cAMP表达水平调节“膜钟”与“Ca2+钟”，且观察到自发LCR事件[5]。通过在大动物心室中直接注射TBX18基因发现心率可呈现昼夜变化且其心率受自主神经调节，搏位点起源于注射部位说明确实是TBX18在起作用。这种方法也不会引起的额外的心律失常，其他测量指标与正常动物相似[6]。说明TBX18可重编程心肌细胞从而发挥稳定的起搏功能。

成纤维细胞作为心脏中最主要的非心肌细胞，占到细胞总数的45%～75%[9]，且心肌与成纤维细胞成交错排列。生理状态下，成纤维细可通过不断合成和降解胶原蛋白与纤维连接蛋白起到支撑心脏结构的作用；还可通过与心肌形成缝隙连接蛋白直接影响心肌的电生理活动[10]。成纤维细胞是非兴奋细胞，且其膜电阻较高、静息电位成去极化相，且可产生机械敏感的电流。体外共培养时，心肌细胞与成纤维细间可形成Cox43和45供传导冲动；成纤维细胞还能使比邻的心肌细胞去极化从而降低其兴奋性和传导速率[11]。基于以上特点，成纤维细胞常被当做治疗心律失常的靶点进行研究，如抑制成纤维细胞中Cox蛋白的表达提高传导速率[12]或转染MyoD可使成纤维细胞表达肌小管和心肌特异性蛋白从而促进传导[13]。基于以上研究结果我们有理由提出如下假设:①在体动物心脏中注射TBX18基因，不仅心肌细胞可被转染，成纤维细胞也可被转染；②成纤维细胞经TBX18基因修饰后可改变其电生理特性，进而改变比邻心肌的电生理特性。

HCN4是窦房结细胞在自动去极化时产生If的主要离子通道。胚胎发育早期心肌细胞与窦房结起搏细胞在结构与功能上相似，但在发育后期随着HCN4的减少与If电流消失逐渐丧失其起搏功能。因此HCN4是维持窦房结细胞电生理功能的特异性蛋白。本研究结果显示成纤维细胞转染TBX18后HCN4蛋白表达增高，且通过膜片钳记录到电压敏感的If，但并不能产生自发的动作电位，说明TBX18并不能像重编程心肌细胞一样促使成纤维细胞转变为起搏细胞。但用转染TBX18的成纤维细胞共培养的心肌细胞搏动频率比未转染TBX18的成纤维细胞共培养的心肌细胞高20次/min，可能跟成纤维细胞膜上HCN4蛋白产生的去极化电流经缝隙连接流入比邻的心肌细胞，促进心肌细胞动作电位4相自动去极化有关。

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Expression of HCN4 protein and If in cardiac fibroblasts of rats transfected with human TBX18 gene and its effect on cardiomyocyte pulsation frequency

QUANDajun1,CAOZheng,YANGMei,LISha

(1RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China)

Objective To observe the expression of HCN4 protein, If and its effect on the pulsation frequency of cardiomyocytes in cardiac fibroblasts transfected with human TBX18 gene.Methods The hearts were extracted after decapitation of the newborn SD rats, and the fibroblasts and cardiomyocytes were isolated and cultured. Adenovirus vector Ad-GFP-TBX18 was constructed and the virus titer was purified to 1×1010TU/mL. The fibroblasts were divided into groups A, B and C at the time of passage 2 to 5. After 24 hours of culture, groups A and B were transfected with Ad-GFP-TBX18 and pHBAd-MCMV- GFP, respectively, and group C without any treatment. The mRNA expression of TBX18 mRNA was detected by RT-PCR. The hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel 4 (HCN4) protein was detected by Western blotting. The hyperpolarization activated inward current (If) was recorded by voltage clamp. The fibroblasts of each group were co-cultured with neonatal rat cardiomyocytes to observe the frequency of cardiomyocytes in neonatal rats.Results The relative expression levels of TBX18 mRNA in the groups A, B and C were 98.32±6.21, 1.03±0.05 and 1.02±0.02, respectively. The relative expression of TBX18 mRNA in the group A was higher than that in the groups B and C (allP<0.05). There was no significant difference in the relative expression of TBX18 mRNA between group B and group C. The relative expression of HCN4 protein in the groups A, B and C were 0.49 ± 1.21, 0.12 ± 0.02, and 0.09 ± 0.01, respectively. The relative expression of HCN4 protein in the group A was higher than that in the groups B and C (P<0.05). There was no significant difference in the relative expression of HCN4 protein between group B and group C. About 30% of the cells in group A were able to detect If, whereas in the groups B and C we did not detect If. At the same time, the frequency of cardiomyocyte pulsation in group A was higher than that in the groups B and C (allP<0.05). There was no significant difference in the frequency of cardiomyocytes between groups B and C.Conclusion HCN4 protein is highly expressed in rat cardiac fibroblasts transfected with human TBX18 gene and the If currents are present, which may promote the pulsation of neonatal rat cardiomyocytes.

TBX18 gene; gene transfection; fibroblast; cardiomyocyte; hyper-activated cyclic nucleotide-gated cation channel 4; hyperpolarization-activated inward current; heart pacing; animal experiment

国家自然科学基金面上项目(81270249)；国家自然科学基金面上项目(81570306)；湖北省科技支撑计划项目(2013BCB013)。

权大君(1991-)，男，硕士研究生在读，主要研究方向为心电生理。E-mail: 411108619@qq.com

简介：曹政(1977-)，男，医学博士，教授，副主任医师，主要研究方向为冠心病与电生理。E-mail: caozheng908@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.47.006

R54

A

1002-266X(2016)47-0021-04

2016-05-05)