miRNA调节骨髓间充质干细胞成骨分化作用研究

张文明，张媛媛，林燕萍（福建中医药大学，福建福州350122）



miRNA调节骨髓间充质干细胞成骨分化作用研究

The effects of imRNA in regulating osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

张文明，张媛媛，林燕萍
（福建中医药大学，福建福州350122）

关键词成骨分化；miRNA；BMSCs

miRNA是一类具有转录后调控功能作用的单链小RNA。从1993年在秀丽线虫发育时期发现第一个miRNA后，miRNA的研究取得巨大突破，目前在多种生物体内发现数量庞大的miRNA，并且观察到miRNA具有极其丰富的生物学功能，对生物体的发育代谢凋亡过程均具有调控作用。miRNA是一种非编码的小RNA，长度约为19～25个核苷酸，具有高度保守性。大约占到整个人类基因组的1%，调控人类30%以上基因的表达。参与各种生物体细胞早期发育和生长、增殖、分化、分裂以及凋亡，并且参与重要基因的调控、体液调节、组织重建、内分泌调节，对疾病的发生、发展、转归都具有重要影响［1-3］。其在多种生物体内具有高度保守性，在不同的生物体系均起着关键作用，促进快速应答与机体生理和结构的精确调控。它们基于与靶基因的3′非翻译区序列互补，从而对靶基因进行降解或抑制，达到调控蛋白质表达的目的。

1 miRNA的作用机制

miRNA可通过两种不同的机制来达到对靶基因的调控：mRNA剪切与翻译抑制。近期多数研究均表明，miRNA抑制或沉默靶基因mRNA的方式，决定于其与靶基因3′非翻译区序列互补的程度。当miRNA与靶基因mRNA的3′非翻译区序列完全互补时即可导致mRNA降解，当miRNA与靶基因3′非翻译区序列不完全互补时可以导致mRNA抑制，说明miRNA与靶基因mRNA相互配对程度决定了其对靶基因调控的方式。由于多数miRNA与靶基因mRNA完全互补程度并不高，目前发现miRNA对靶mRNA的主要作用方式主要是抑制作用。同时miRNA也可上调靶基因的表达，从而对靶基因起到正性调控作用。研究表明大约40%～90%编码蛋白的基因3′非翻译区均存在miRNA靶作用点［4］，目前认为人类基因组中有1 048条miRNA［5］，而人类30%～40%的基因在翻译水平受miRNA的调控［6］。单个miRNA可以有多个靶基因mRNA，单个基因也可以被多个miRNA调控［7］。

miRNA的靶mRNA主要是细胞生物学过程中的转录因子、调节因子、生长因子等，研究miRNA的功能主要通过研究其与靶基因的关系，其作用机制为miRNA 5′端的种子区与其靶基因3′UTR区结合，说明只要找到细胞中miRNA的靶mRNA，就可以研究细胞中该miRNA的作用，靶基因的确定至关重要。由于miRNA及其靶基因mRNA序列在物种间具有高度保守性，这为miRNA的预测奠定了基础。目前研究miRNA-靶mRNA之间相互作用的方法包括：靶基因预测软件预测、荧光素酶报告基因检测、构建载体上调miRNA的表达和下调miRNA的表达检测目标mRNA。其中利用表达谱分析和生物信息学方法预测靶基因为miRNA功能研究提供大量线索。利用生物信息学技术用计算机软件预测靶mRNA后，还需通过蛋白基因组学实验研究来验证靶基因的可靠性。根据miRNA调控机制的不同，实验研究验证分为两个方面：通过对降解产物的逆转录和克隆测序可以完成对靶基因mRNA降解作用的验证。对于翻译抑制机制，需要采用荧光素酶报告基因系统，构建载体上调和下调miRNA对靶mRNA进行双荧光验证、蛋白组学分析。

2 miRNA调控BMSCs成骨分化

成骨细胞来源于骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）［8］，即决定骨形成的成骨细胞由BMSCs分化成熟而来，BMSCs的数量和成骨分化功能直接影响成骨细胞的数量和功能活性，因此BMSCs向成骨细胞分化对维持骨稳态非常重要。那么miRNA在BMSCs向成骨细胞分化中有何作用呢？2008年，Kobayashis发现在敲除了小鼠的内切核酸酶Dicer后，小鼠BMSCs成骨分化功能消失［9］。小鼠软骨细胞数量明显减少，软骨生成减少，密度下降。Dicer是miRNA合成所必需的一个内切酶，说明miRNA在骨形成和发育中有重要作用［10］。BMSCs的增殖活性与成骨分化过程均与miRNA密切相关。BMSCs成骨分化过程涉及多条信号通路，如BMP信号通路、Wnt信号通路、TGF-β通路、Notch信号通路等［11］。一般来说miRNA对基因进行负性调控，因此miRNA对成骨分化的作用可以是作用于促进成骨的基因而抑制成骨，也可以是作用于抑制成骨作用的基因，从而间接地对成骨进行正性调控［12］。

2.1促进成骨分化的miRNA

Li Z等［13］发现在MC3T3细胞成骨分化过程中，miR-29b可以通过作用于抑制成骨的靶基因HDAC4、TGF-β3、ACVR2A，通过降解作用，阻止其表达，从而促进成骨。此外还有研究发现miR-29a通过抑制DKK1来激活WNT通路，通过与WNT通路形成循环来促进成骨分化［14］。同样，也有研究发现miR-27可以抑制靶基因APC，从而反激活WNT促进成骨分化［15］。Liu Y等［16］认为miR-17可能通过抑制牙周膜间充质干细胞成骨分化的负性调控因子Smurf1，从而促进牙周膜间充质干细胞的成骨分化。He J等［17］发现miR-20b通过与其靶基因PPARγ结合，降低PPARγ的表达，从而提高了成骨核心转录因子Runx2转录，促进成骨分化。该研究认为PPARγ通过促进成酯分化，抑制成骨分化的转录因子。Zhou Q等［18］用伊班磷酸钠干预牙周膜间充质干细胞后发现，miR-18及相关成骨转录因子表达上升，表明miR-18可能在伊班磷酸钠促进牙周膜间充质干细胞成骨分化过程中起到正性调控作用。miR-210在ST2成骨分化过程中可能通过沉默抑制成骨分化的重要基因AcvR1b来促进成骨，过表达miR-210后碱性磷酸酶、成骨核心结合因子Runx2的表达上升［19］。

2.2抑制成骨分化的miRNA

Wei J等［20］发现，miR-34b和miR-34c作为miR-34家族的2个成员通过两条途径来实现抑制成骨的作用，一方面CDK4、CDK6和CyclinD1蛋白积累等被miR-34b和miR-34c所阻碍，从而抑制了成骨细胞的数量；另一方面SATB2蛋白的表达降低从而抑制成骨细胞的分化。Li Z等［21］发现在BMP2诱导的C2C12细胞成骨分化中，对其中显著下调的miR-133和miR-135进行研究后发现，miR-133的靶基因为Runx2，而miR-135的靶基因为Smad5，两者共同作用来抑制骨的形成。那么在临床上可以通过降低miR-133和miR-135的表达来促进成骨作用，最终达到改善骨重建的作用。Wang X等［22］研究发现老年骨折患者的骨组织中高表达miR-214，miR-214是通过作用于活化转录因子4ATF4来降低成骨作用的。在动物实验中miR-214也被证实具有抑制成骨细胞活性的作用。Eskildscn T等［23］发现miR-138可以直接作用于成簇黏附激酶FAK，抑制FAK-ERK1/2信号通路，从而降低下游成骨核心结合因子Runx2和OSX的表达来降低成骨作用。同样，在人骨髓间充质干细胞中过表达miR-138后骨形成下降，低表达miR-138后成骨作用增加。Zeng Y等［24］发现miR-100抑制干细胞成骨分化，该作用通过降低骨形态发生蛋白受体BMP-2来实现。Gao J［25］分离培养人的BMSCs后在成骨分化过程中筛选分化前后miRNA差异最大的hsa-miR-31、hsa-miR-106a、hsa-miR-148a，并且发现这些miRNA可能通过成骨核心结合因子Runx2、CBFB和BMPs起作用。Schaap-Oziemlak A M等［26］发现hsa-miR-135b可能作用于IBPS和Osterix，在无限成体干细胞（USSCs）中显著下调。同样miR-637在间充质干细胞向成骨细胞分化中表达也降低，可能也是通过靶基因Osterix起作用的。

3展　望

研究证实miRNA几乎参与了生物学行为中所有的基因调控通路，具有极强的调控作用。miRNA对干细胞自我更新和分化调控机制是必须要明确的，也是目前科学家正在努力研究的热点课题。生物，包括人类，在对环境适应及进化过程中伴随着频繁而持续的基因—基因和基因—环境相互作用，miRNA的高度保守性决定了其非常适合研究基因—基因和基因—环境相互作用。针对某种特殊疾病的病理，可能对某些特定表型具有阳性或阴性效应的miRNA基因，用生理及遗传病理模型评估阳性miRNA与蛋白编码基因潜在作用靶点的关系，从而用于疾病的诊断与治疗，可能将成为未来基因与疾病研究的热点，miRNA基因效应的分子生理学认识可能会带来直达作用靶点的治疗。

在一些增龄性疾病如绝经后骨质疏松症（PMOP）的研究中，经过生物信息学预测及基因芯片的筛选，发现某些特定的miRNA可能控制着BMSCs向成骨细胞分化，这些miRNA通过降低或提高成骨关键转录因子来抑制或促进BMSCs的成骨分化过程。越来越多的证据显示，某些miRNA调控作用具有高度保守性，在进化过程中以及不同物种间还保持完整的作用。可以通过检测绝经前后患者骨组织或血液、体液中的特异基因miRNA，由此来进行PMOP的诊断。而进一步发展和调整miRNA干扰载体，使它能在BMSCs成骨分化中起到促进成骨作用，从而预防和治疗PMOP，这将是一种全新的PMOP诊治模式。但成骨过程中有多少特异性miRNA参与对BMSCs生物学行为调控?这些特异性miRNA又如何调控促进代谢性骨病的发生？能否通过降低或提高特异性miRNA改变BMSCs的生物学特性？有待于我们进一步研究。

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（编辑：梁葆朱）

中图分类号：Q522

文献标识码：A

文章编号：1671-0258（2016）02-0060-03

［基金项目］国家自然科学基金项目（81173282）

［作者简介］张文明，在读博士，E-mail：393390125@qq.com

［通讯作者］林燕萍，教授，博士研究生导师，E-mail：lyp66@126.com