HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA检测在宫颈癌筛查中的应用价值探讨

蒙志平, 黎勇明, 杨　玲, 吴　险, 梁金艳,林丽文, 梁　婷, 黄川英

(广西壮族自治区贵港市人民医院, 1. 检验科; 2. 妇科, 广西 贵港, 537100)



HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA检测在宫颈癌筛查中的应用价值探讨

蒙志平1, 黎勇明2, 杨玲1, 吴险1, 梁金艳2,林丽文1, 梁婷2, 黄川英1

(广西壮族自治区贵港市人民医院, 1. 检验科; 2. 妇科, 广西 贵港, 537100)

摘要:目的探讨HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA检测在宫颈癌筛查中的应用价值。 方法选取宫颈病变筛查的受试者407例为研究对象，均行宫颈薄层液基细胞学(TCT)检查，并检测细胞学标本中HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA的表达。215例行阴道镜宫颈活检，结合组织病理诊断结果进行统计分析。结果407例细胞病理学诊断结果：正常范围(WNL)192例(47.17%)、意义不明的不典型鳞状上皮细胞(ASCUS)106例(26.04%)、低度鳞状上皮内病变(LSIL)70例(17.20%)和高度鳞状上皮内病变(HSIL)39例(9.58%)。诊断为LSIL和HSIL患者中，HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA检出率差异无统计学意义(P>0.05); 诊断为ASCUS患者中, HPV DNA检出率显著高于HPV E6/E7 mRNA (P<0.01)。215例组织病理学诊断结果：正常109例，阴性106例，包括CIN Ⅰ级44例、CIN Ⅱ级27例、CIN Ⅲ级32例、宫颈鳞癌3例。对于诊断为CIN Ⅱ级、CIN Ⅲ级/宫颈癌患者，HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA检测的灵敏度、特异度和阳性预测值差异无统计学意义(P>0.05), 但HPV E6/E7 mRNA检测的阴性预测值和准确度显著高于HPV DNA检测(P<0.05或P<0.01)。结论HPV E6/E7 mRNA检查较HPV DNA检查能更好地评估HPV感染患者宫颈病变恶化风险，联合TCT检测对提高宫颈癌早期筛查和诊断的准确度具有积极意义。

关键词:宫颈癌; 宫颈上皮内瘤变; 人乳头瘤状病毒; HPV DNA; E6/E7基因

宫颈癌是临床妇科常见恶性肿瘤之一，主要是由宫颈上皮内瘤变(CIN)逐步发展为浸润癌的长期病变过程。流行病学统计显示，中国宫颈癌发病率由1989—1990年的3.06/10万上升至2007—2008年的11.87/10万[1]，而预防和控制宫颈癌发病和死亡的关键是有效的早期筛选、诊断和治疗[2]。宫颈疾病诊断中，薄层液基细胞学检查(TCT)使用较为普遍，但因操作等主观因素易造成漏检或假阳性出现。另一方面，鉴于高危型人乳头瘤状病毒(HR-HPV)和宫颈癌及癌前病变发生密切相关[3-4]，HPV DNA检测能直接反映宫颈宿主细胞感染HPV，联合TCT能提高诊断筛选的阳性检出率、敏感性。但也有学者提出HPV DNA检测不能反映HPV病毒感染后的活性状态[5]。研究[6]显示，HR-HPV的持续感染可通过上调HPV E6/E7肿瘤蛋白表达启动致癌过程，HPV E6/E7 mRNA表达与病变严重程度密切相关，因此HPV E6/E7 mRNA检测在宫颈癌初步筛查中是否更具有诊断价值是目前临床研究的热点。本研究比较了TCT联合HPV DNA、TCT联合HPV E6/E7 mRNA在宫颈癌早期诊断中的应用价值，现报告如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2014年10月—2015年10月在贵港市人民医院妇科行宫颈病变筛查的受试者407例为研究对象，年龄18～66岁，平均(37.5±9.2)岁；152例患者有明显临床症状，为阴道分泌物增多、白带异常、接触性出血，214例伴有不同程度的宫颈糜烂。排除标准: ① 子宫切除、宫颈手术或盆腔放射治疗史; ② 合并其他系统肿瘤或宫颈上皮内病变史(CIN≥2级); ③ 取材前阴道用药或行阴道冲洗; ④ 妊娠期患者。所有受试者均行TCT、HPV DNA、HR-HPV E6/E7 mRNA检查和宫颈活体组织病理学检查。

1.2方法

1.2.1样本采集：采用专用宫颈刷置入宫颈内鳞柱状上皮交界处顺时针旋转3～5圈。取出专用刷后置于含有专用细胞保存液的试管中，刷洗8～10次后将细胞洗脱后封管，-20 ℃保存备检。

1.2.2TCT检测：采用膜式液基超薄细胞学和离心沉淀技术，宫颈脱落细胞经固定、染色后，由检验科医师依据国际癌症协会推荐的Bethesda系统(TBS)进行细胞病理学诊断，分为正常范围(WNL)、意义不明的不典型鳞状上皮细胞(ASCUS)、低度鳞状上皮内病变(LSIL)，高度鳞状上皮内病变(HSIL)、鳞状细胞癌(SCC)和意义不明的不典型腺体上皮细胞(AGCUS)。

1.2.3HPV DNA检测：采用凯普公司点杂交的采样工具包从宫颈管采集标本，检测21种HPV亚型，包括世卫组织(WHO)关于宫颈癌筛查必须具备的13种高危型HPV DNA(16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68)，5种低危型6, 11, 41, 42, 44以及3种常见亚型53, 66和CP8304。

1.2.4HPV E6/E7 mRNA检测：用专用宫颈刷于宫颈外口及颈管内旋转5圈，折断刷柄，置于专用保存液瓶中待用，根据科蒂亚(新乡)试剂盒检测要求经过信号放大、加入标记荧光物质的底物后，在配套冷光仪光度计上检测。检测结果为拷贝数，经公司计算软件自动判断结果。

1.2.5组织病理学检查：对于ASCUS或更高级别的异常细胞学结果，阴道镜下取宫颈活体组织，送病理检查，病理诊断结果依据TBS分类系统分为未见上皮内病变或恶性病变(NILM)、宫颈上皮内瘤样病变CIN(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)和宫颈癌。

1.3统计学处理

采用SPSS 13.0 软件，计数资料以百分率(%)表示，采用χ2检验，以病理学检查结果为金标准，计算不同检验方法对CIN Ⅱ、CIN Ⅲ的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1细胞病理学、HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA病理学检查结果

407例患者均行TCT检查，其中HPV DNA检测阳性197例(48.40%)，HPV E6/E7 mRNA检查阳性127例(31.20%)。细胞病理学诊断结果：WNL 192例(47.17%), ASCUS 106例(26.04%)，LSIL 70例(17.20%)，HSIL 39例(9.58%)。细胞学检查标本中215例行阴道镜宫颈活检，组织病理学诊断正常109例，阳性106例，包括CIN Ⅰ级44例、CIN Ⅱ级27例、CIN Ⅲ级32例、宫颈鳞癌3例。

2.2不同细胞病理学分级HPV DNA、HPVE6/E7 mRNA检出情况

不同细胞病理学分级下HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA检出率比较见表1。诊断为ASCUS患者中, HPV DNA检出率高于HPV E6/E7 mRNA, 差异有统计学意义(P<0.01); 诊断为LSIL和HSIL 患者中，HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA检出率差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3不同组织病理学分级HPV DNA、HPVE6/E7 mRNA检出情况

不同组织病理学分级HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA检出率比较见表2。将3例宫颈癌患者纳入CIN Ⅲ级合并计算，CIN Ⅱ级和CIN Ⅲ级/宫颈癌患者中，HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA检出率差异无统计学意义(P>0.05)；CIN Ⅰ级患者中，HPV DNA检出率显著高于HPV E6/E7 mRNA，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA检测对不同组织病理学诊断价值

以215例行阴道镜宫颈活检的患者为研究对象。对于诊断为正常的患者，2种方法灵敏度、特异度差异无统计学意义(P>0.05), HPV E6/E7 mRNA阳性预测值和准确度显著低于HPV DNA检测(P<0.05或P<0.01), 但阴性预测值显著高于HPV DNA检测(P<0.05); CIN Ⅰ级患者中，2种方法灵敏度、特异度和准确度差异无统计学意义(P>0.05), HPV E6/E7 mRNA阳性预测值显著低于HPV DNA检测(P<0.05)，阴性预测值显著高于HPV DNA检测(P<0.01); CIN Ⅱ级中，2种方法灵敏度、特异度和阳性预测值差异无统计学意义(P>0.05), HPV E6/E7 mRNA检测的阴性预测值和准确度显著高于HPV DNA检测(P<0.05或P<0.01); CIN Ⅲ级/宫颈癌患者中，2种方法灵敏度、特异度和阳性预测值差异无统计学意义(P>0.05), HPV E6/E7 mRNA检测的阴性预测值和准确度显著高于HPV DNA检测(P<0.05或P<0.01)。见表3。

3讨论

宫颈癌发病率仅次于乳腺癌，是中国女性常见恶性肿瘤之一。研究[7]报道，HR-HPV持续感染是宫颈癌及其癌前病变发生发展的必要条件，因此检测HPV DNA的持续感染能有助于宫颈癌及其癌前病变的早期诊断和治疗。但多数患者HPV感染呈一过性，而呈HPV持续感染患者宫颈上皮细胞发生恶化前通常经历5～10年的癌前病变阶段，因此HPV DNA检测对宫颈疾病恶化风险预测效果可能不理想[8]。另一方面，HPV基因组包括两类编码基因区，即7个早期区(E1、E2、E4、E5、E6、E7和E8)基因和2个晚期区(L1和L2)基因，其中由E6/E7基因编码的致癌蛋白是导致宫颈上皮癌变的重要因子。HPV DNA整合于宿主染色体脆弱区，破坏编码特异性DNA束缚蛋白的E2区，引起E6和E7两种癌基因的过表达，通过抑制抑癌基因功能、激活端粒酶活性等机制，最终导致细胞周期失控、永生化成为癌细胞[9]。研究[10]提示，宫颈组织中HPV E6/E7 mRNA 表现出癌基因活性，对于持续HPV感染患者，HPV E6/E7 mRNA异常表达往往预示着细胞恶化风险增高。本研究观察到，TCT检查诊断为ASCUS患者中，HPV DNA检出率高于HPV E6/E7 mRNA(P<0.01), 但在诊断为 LSIL和HSIL 患者中，HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA检出率差异无统计学意义(P>0.05), 与相关文献报道基本一致[11-12]。

Rijkaart等[13]指出，HPV E6/E7 mRNA表达随着宫颈病变级别升高呈增加趋势。本研究中，不同组织病理学分级患者诊断效率的比较结果显示，CIN Ⅱ级、CIN Ⅲ级/宫颈癌患者中，HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA检测的灵敏度、特异度和阳性预测值差异无统计学意义(P>0.05)，但HPV E6/E7 mRNA检测的阴性预测值和准确度显著高于HPV DNA检测(P<0.05或P<0.01)，提示HPV E6/E7 mRNA更适用于评估宫颈疾病恶化风险。

与HPV DNA比较, *P<0.05, **P<0.01

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Application value of HPV DNA and HPV E6/E7 mRNA assay in screening of cervical cancer

MENG Zhiping1, LI Yongming2, YANG Ling1, WU Xian1, LIANG jinyan2,LIN Liwen1, LIANG Ting2, HUANG Chuanying1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory; 2.DepartmentofGynecology,GuigangPeople′sHospital,Guigang,Guangxi, 537100)

KEYWORDS:cervical cancer; cervical intraepithelial neoplasias; human papillomavirus; HPV DNA; HPV E6/E7 mRNA

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the application value of HPV DNA and HPV E6/E7 mRNA assay in screening of cervical cancer. MethodsA total of 407 cases received Thinprep Cytology Test (TCT), HPV DNA and HPV E6/E7 mRNA assay. The cervical biopsy by colposcopy was performed in 215 cases and the data according to cytological and pathological results were statistically analyzed. ResultsThere were 192, 106, 70 and 39 cases diagnosed as normal limits (WNL), atypical squamous cells of undetermined significance (ASCUS), lower-grade squamous intraepithelial lesions (LSIL)and higher-grade squamous intraepithelial lesions (HSIL) according to cytological results respectively. There was no significant difference in positive rate of HPV DNA and HPV E6/E7 mRNA in those patients with cytological results of LSIL and HSIL (P>0.05). The positive rate was higher in HPV DNA than that of HPV E6/E7 mRNA in ASCUS patients (P<0.05). Out of 215 cases, 106 cases were confirmed with positive pathological results, including 44 cases of CIN Ⅰ, 27 cases of CIN Ⅱ, 32 cases of CIN Ⅲ and 3 cases of cervical cancer. There was no significant difference in sensitivity, specificity, positive predict value between HPV DNA and HPV E6/E7 mRNA assay in diagnosis of CIN Ⅱ and CIN Ⅲ/cervical cancer(P>0.05), but HPV E6/E7 mRNA assay had a higher negative predictive value and accuracy compared with the HPV DNA assay (P<0.05 orP<0.01). ConclusionHPV E6/E7 mRNA assay shows advantage in predicting risk of deterioration of cervical lesions. The combination of TCT and HPV E6/E7 mRNA assay is more valuable in screening of cervical cancer.

收稿日期:2015-12-16

中图分类号:R 737.33

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2016)11-076-04

DOI:10.7619/jcmp.201611022