消银合剂对银屑病小鼠模型血清Th17细胞相关因子表达的影响

李舒佳, 闵仲生, 朱晓芳, 赵　莎

(1. 南京中医药大学，江苏 南京, 210029; 2. 江苏省中医院, 江苏 南京, 210029;3. 扬州大学临床医学院, 江苏 扬州, 225001)



消银合剂对银屑病小鼠模型血清Th17细胞相关因子表达的影响

李舒佳1, 闵仲生2, 朱晓芳3, 赵莎3

(1. 南京中医药大学，江苏 南京, 210029; 2. 江苏省中医院, 江苏 南京, 210029;3. 扬州大学临床医学院, 江苏 扬州, 225001)

摘要:目的观察消银合剂对银屑病小鼠模型外周血清中的Th17细胞相关因子表达的影响。方法40只BALB/c雌性小鼠随机分为空白对照组、模型组、消银合剂高、低剂量组和甲氨蝶呤组，每组8只。采用咪喹莫特乳膏诱导小鼠银屑病模型，采用银屑病皮损面积和疾病严重程度(PASI)评分标准观察银屑病样小鼠皮损的变化情况。采用ELISA方法检测血清Th17细胞相关因子IL-17、IL-22、IL-6、TNF-α的变化。结果消银合剂组小鼠银屑病样皮损程度轻于模型组，PASI评分降低，血清Th17细胞相关因子表达明显低于模型组。甲氨蝶呤组小鼠银屑病皮损程度轻于模型组，PASI分数降低，血清Th17细胞相关因子表达明显低于模型组。结论消银合剂可能通过下调Th17细胞相关因子的表达来减轻银屑病小鼠的皮肤病变。

关键词:银屑病; 银屑病小鼠模型; 消银合剂; Th17细胞相关因子

银屑病是一种以鳞屑性红斑为临床特点的慢性复发性炎症性皮肤病，目前多认为是免疫因素、遗传因素、环境因素精神因素等多因素相互作用的多基因遗传病，免疫介导是其主要发生机制。细胞因子网络在银屑病发病机制中的作用已成为当前研究的热点。咪喹莫特(IMQ)为免疫激活剂，可与Toll样受体作用致免疫激活，诱发小鼠皮肤产生银屑病样皮损改变[1]。本实验以银屑病样小鼠模型为基础，观察消银合剂对小鼠皮损变化及Th17细胞相关因子变化的影响，现报告如下。

1材料与方法

1.1动物

雌性BALB/c小鼠40只，体质量18～20 g，由扬州大学比较医学中心提供，实验动物使用许可证编号SYXK(苏)2012-0029，饲养于SPF级动物室。

1.2试剂与药品

消银合剂(江苏省扬州市中医院制剂室)；咪喹莫特(四川明欣药业有限责任公司)；凡士林乳膏(南昌白云药业有限公司)；甲氨蝶呤(江苏恒瑞医药股份有限公司)；IL-17、IL-6、TNF-α、IL-22等ELISA试剂盒(Boster Biological Technology Co. Ltd)。

1.3方法

1.3.1实验动物准备：BALB/c小鼠用戊巴比妥钠(80 mg/kg)经腹腔注射麻醉，刮除背部毛发，形成2 cm×3 cm暴露区域，单笼饲养按组别分别给予药物处理。1.3.2实验分组及给药：将小鼠随机分为空白对照组、模型组、消银合剂高、低剂量组、甲氨蝶呤组，每组8只。除空白组小鼠每日背部涂抹凡士林42 mg, 其余4组小鼠每日背部涂抹5%咪喹莫特乳膏42 mg。5组小鼠同时灌胃给药。空白对照组与模型组分别与予生理盐水0.1 mL; 消银合剂高剂量组予浓度为14.36 g/(kg·d)消银合剂溶液；消银合剂低剂量组予浓度为7.18 g/(kg·d)消银合剂溶液；甲氨蝶呤组给予MTX 1 mg/( kg·d), 连续12 d。

1.3.3检测变化及方法：用数码相机每天拍照记录，并依据PASI评分标准(0分为无; 1分为轻度; 2分为中度；3分为重度；4分为极重度)，分别对小鼠皮损处红斑、鳞屑、浸润增厚程度进行评分，并将三者积分相加得到总积分，绘制相应趋势线，观察各组小鼠皮损的变化情况。连续处理小鼠12 d，摘除眼球取血收集血清，用ELISA方法检测相关因子变化；采血后将小鼠脱颈处死，减取小鼠背部相应皮损组织，用HE染色观察组织形态学变化。

1.4统计学处理

采用SPSS 15.0软件进行分析，以均数±标准差表示，两组间均数采用t检验，多组间比较采用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组小鼠背部皮损处红斑、鳞屑、浸润增厚及PASI积分的变化

与空白对照组相比，咪喹莫特乳膏涂抹1 d后模型组皮肤即开始出现红斑、鳞屑，随着药物作用蓄积，模型组皮损红斑颜色由浅变深，鳞屑增多增厚，皮肤浸润明显。第8天前后最严重，形成类似银屑病样皮损。随后继续外用咪喹莫特乳膏，皮损严重程度不再增加，呈逐渐消退趋势。直至12 d后，仅剩少量红斑鳞屑，皮肤增厚也有缓解；甲氨蝶呤组、消银合剂高/低剂量组皮损与模型组相比症状明显减轻，皮肤较光滑，鳞屑较少，红斑色浅，浸润增厚较轻。空白对照组PASI积分趋于0，其余4组PASI积分趋势线均表现为先上升、后下降的变化，PASI积分于1～7 d逐渐上升，第8天达高峰，随后较快降低；咪喹莫特组、低剂量消银合剂组、高剂量消银合剂组、甲氨蝶呤组的PASI积分依次下降。见图1。

2.2 消银合剂对咪喹莫特诱导小鼠银屑病样皮损动物模型组织学变化的影响

HE染色显示：空白对照组皮肤菲薄，见2～3层形态正常的细胞；模型组小鼠表皮明显增厚，可见角化过度伴有角化不全，棘层细胞显著增厚，可见Munro微脓肿，真皮炎症细胞浸润，表现为类似银屑病样改变；与模型组相比，高剂量消银合剂组及甲氨蝶呤组小鼠变化较轻，仅有轻度的角化过度，棘层细胞轻度增厚，2组无明显差异；低剂量消银合剂组皮肤变化程度介于甲氨蝶呤组及IMQ组。见图2。

2.3消银合剂对咪喹莫特诱导银屑病样小鼠血清Th17细胞相关因子表达的影响

空白对照组IL-17、IL-22、IL-6、TNF-α等细胞因子水平较低；与空白对照组相比，模型组细胞因子水平明显升高，约为空白对照组2～3倍，其中TNF-α明显增高，约为空白对照组的8～9倍；高剂量消银合剂组及甲氨蝶呤组细胞因子水平轻度升高，部分接近空白对照组，高剂量消银合剂组细胞因子水平与甲氨蝶呤组接近；低剂量消银合剂组细胞因子水平介于高剂量消银合剂组及模型组。见表1。

与空白组比较, *P<0.05; 与模型组比较, △P<0.05; 与高剂量消银合剂组比, #P<0.05。

3讨论

银屑病是一种以T淋巴细胞活化和浸润为主要特征的慢性炎症性疾病，病程长、易复发、难治愈，目前已被定义为器官特异性的自身免疫性疾病[2]。近期研究[3-4]表明，Thl7细胞在银屑病及其他免疫介导的炎症性疾病中发挥较大作用。

IL-17是一种促炎症细胞因子，主要由Th17细胞产生，具有强大的募集及激活中性粒细胞能力，能诱导活化T细胞，刺激成纤维细胞、巨噬细胞和上皮细胞产生多种促炎递质，如IL-1、IL-6、TNF-α等，进而诱导炎症发生[5]。TNF-α是一种在炎症和自身免疫性疾病中具有广泛生物学活性的细胞因子，它可诱导血管内皮细胞产生炎症介质，通过多种方式直接或间接地诱导银屑病的病理发生[6]。此外，IL-17还与TNF-α等炎症因子协同，放大加强其致炎效应。IL-22可通过抑制角质形成细胞的分化、诱导银屑病样表皮改变参与银屑病发病[7]。IL-6能诱导Th22细胞产生 IL-22, 进而激活STAT3信号转导通路，然后以IL-22为主、联合TNF-α共同介导银屑病的进程和棘皮症发展[8]。

本研究对小鼠模型进行了0～12 d的观察，发现咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮损随着时间的延长呈现抛物线样的动态变化：在咪喹莫特乳膏涂抹1～2 d后小鼠皮肤即出现红斑、鳞屑，第7～8天时红斑、鳞屑及浸润现象最严重，此后随着咪喹莫特给药时间延长，皮损不再加重，有减缓趋势。从小鼠银屑病样皮损PASI评分趋势图可以看出这一动态变化过程[9-10]。由以上结果可以推测，咪喹莫特外用诱导的小鼠银屑病样皮损可能是一个暂时的炎症爆发，该模型在咪喹莫特持续作用下可能发生药物适应、耐受现象，致使皮损出现自限性倾向[11-12]。因此，可认为咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样动物模型有时间窗的限制，前8 d为疾病的发生、发展阶段，可应用于银屑病发病机制探索、药物筛选及干预作用机制研究[13-14]。

消银合剂由土槐饮(土茯苓、槐花、甘草)主方加减而成，土茯苓具有选择性抑制细胞免疫反应、抗肿瘤等作用，槐花具有保持毛细血管的正常抵抗力、减少血管通透性、对抗炎症等作用[15]。银屑病主要病理特征为表皮增殖活跃、角化不全、炎症细胞浸润、血管增生等[16]。实验发现，消银合剂治疗咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮损，颜色由鲜红或深红转为淡红，皮疹变薄，鳞屑脱落减少，面积缩小，或全部消退，皮肤症状得以明显缓解，PASI积分显著降低；IL-17、TNF-α、IL-6、IL-22等Th17细胞相关因子水平显著下降；组织形态变化趋于正常，角化不全的细胞减少；炎症浸润程度降低；新生血管数量减少[17]。提示消银合剂有明显的抗炎作用，可能与降低Th17细胞相关因子水平，进而改善T淋巴细胞在银屑病发病中的作用有关。

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Effect of psoriasis-eliminating preparation on expressions of Th17-related factors in psoriasis mouse model

LI Shujia1, Min Zhongsheng2, ZHU Xiaofang3, ZHAO Sha3

(1.NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing,Jiangsu, 210029;2.JiangsuProvincialTCMHospital,Nanjing,Jiangsu, 210029;3.ClinicalMedicineCollegeofYangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu, 225001)

KEYWORDS:psoriasis; psoriasis-eliminating preparation; psoriasis mouse model; Th17-related factors

ABSTRACT:ObjectiveTo observe the effect of psoriasis-eliminating preparation on the expressions of Th17-related factors in psoriasis mouse model. MethodsA total of 40 BALB/c female mice were randomly divided into blank control group, model group, high and low dose of psoriasis-eliminating preparation group, and methotrexate group, 8 mice in each group. Psoriasis mouse model was induced by imiquimod. The severity was assessed by psoriasis area and severity index (PASI). ELISA was used to detect changes of IL-17, IL-22, IL-6 and TNF-α. ResultsDegree of psoriasis like lesions in psoriasis-eliminating preparation group was less than that in model group, the PASI score decreased, and expressions of Th17-related factors were obviously lower than the model group. Degree of psoriasis like lesions in methotrexate group was less than model group, the PASI score decreased, and expressions of Th17-related factors were obviously lower than the model group. ConclusionPsoriasis-eliminating preparation may reduce the skin lesions of psoriasis mice by down regulate expressions of Th17-related factors.

收稿日期:2015-11-24

中图分类号:R 758.63

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2016)11-004-04

DOI:10.7619/jcmp.201611002