不同亚型乳腺癌组织中p16基因甲基化与蛋白表达及临床病理特征的关系

张顺礼, 胡继卫, 马　杰, 张景华, 王　宇, 谷　峥, 陈晶晶

(河北省唐山市人民医院 乳腺外一科, 河北 唐山, 063001)



不同亚型乳腺癌组织中p16基因甲基化与蛋白表达及临床病理特征的关系

张顺礼, 胡继卫, 马杰, 张景华, 王宇, 谷峥, 陈晶晶

(河北省唐山市人民医院 乳腺外一科, 河北 唐山, 063001)

摘要:目的探讨不同亚型乳腺癌组织中p16基因甲基化与蛋白表达及临床病理特征的关系。方法PCR法检测55例乳腺浸润型导管癌组织中p16基因甲基化情况，免疫组化法检测p16蛋白表达情况，分析p16基因甲基化与蛋白表达及临床病理特征的关系。结果55例标本中，共12例(21.82%)发生p16基因甲基化，21例(38.18%)p16蛋白表达阳性，其中基底样型基因甲基化发生率显著高于Luminal A型(P<0.05)，蛋白表达阳性率显著低于Luminal A型(P<0.05)。发生基因甲基化的组织中p16蛋白阳性表达率为16.67%，未发生甲基化的组织中阳性表达率为44.19%，差异有统计学意义(P<0.05)。组织学分级Ⅱ～Ⅲ级、伴淋巴结转移及ER蛋白表达阴性的组织中甲基化发生率高于组织学Ⅰ级、无淋巴结转移及ER蛋白表达阳性的组织(P<0.05)。结论p16基因甲基化可能是基底样型乳腺癌的重要分子特征之一，且与乳腺癌的病情进展有关，可能成为预后评估及靶向治疗的重要指标。

关键词:乳腺癌; 基底样型乳腺癌; 抑癌基因p16; 甲基化

It is also valuable to disease prognosis and gene targeted therapy.

乳腺癌发生发展涉及多个基因的异常表达，DNA甲基化、组蛋白修饰、基因组印迹及非编码RNA调控等表观遗传的改变在基因异常表达中起关键作用，尤其是DNA甲基化可抑制抑癌基因转录导致其表达缺失，促进恶性肿瘤的发生与进展[1-2]。抑癌基因p16编码蛋白可抑制细胞周期进展，是重要的细胞周期负向调控因子[3]。p16基因的变异形式包括点突变、甲基化及基因缺失，其中DNA甲基化是其基因失活的最重要机制，且甲基化通常在组织恶变之前就已经发生，对癌前病变的早期诊断具有重要意义。大量研究[4-6]表明，p16基因甲基化在肺癌、甲状腺癌、乳腺癌等恶性肿瘤发生发展中发挥了重要作用，可作为疾病进展的预测指标之一。本研究通过检测不同分子亚型乳腺癌组织中p16基因甲基化及蛋白表达的情况并探讨其相关性，现报告如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2013年5月—2015年5月河北省唐山市人民医院收治的乳腺癌患者55例，纳入标准: ① 符合相关指南[7]标准，经病理学检查确诊为浸润型导管癌; ② 术前未接受放、化疗。患者均为女性，年龄39～60岁，中位年龄50岁；组织学分级：Ⅰ级18例，Ⅱ级22例，Ⅲ级15例；分子亚型：基底样型10例, Luminal A型16例, Luminal B型14例，HER-2过表达型15例。收集55例患者的乳腺癌标本组织待测。本研究经医院伦理学委员会批准，患者均知情同意。

1.2方法

1.2.1仪器和试剂: ① 主要仪器。PCR扩增仪, Oplympus全自动显微镜扫描系统，凝胶成像分析系统，低温高速离心机等。② 主要试剂。p16抗体，石蜡组织DNA提取试剂盒链霉卵白素(SP)试剂盒，DNA甲基化修饰试剂盒，DNA甲基化PCR试剂盒，甲基联苯胺(DAB)试剂等。

1.2.2PCR法检测p16基因启动子甲基化状态：所有标本均经福尔马林固定后石蜡包埋，HE染色。石蜡组织连续切片后按说明书提取基因组DNA，以紫外分光光度仪检测其水平及纯度。DNA经修饰后，未甲基化的胞嘧啶(C)变为尿嘧啶(U)，甲基化的胞嘧啶(Cm)无改变。修饰后的DNA行PCR扩增，甲基化引物片段为150 bp，未甲基化引物片段150 bp。

1.2.3免疫组化SP法检测p16蛋白表达：组织切片脱蜡至水，抗原修复后采用双氧水孵育，血清封闭，滴加p16抗体，PBS冲洗3次，滴加二抗后继续孵育，滴加SP显色。

1.3判定标准

甲基化判定标准：在凝胶成像分析系统下观察DNA扩增产物，出现150 bp产物为基因甲基化，出现151 bp产物为未发生甲基化。

蛋白表达结果判定标准[8]：细胞核和细胞浆均出现棕黄色颗粒为阳性，于高倍镜下随机数10个视野观察，综合染色强度及阳性细胞占肿瘤细胞的比例2项指标进行计分，2项分值乘积>3分判为阳性。

1.4统计学处理

采用SPSS 19.0软件，定性资料采用百分比表示，采用卡方检验；定量资料采用均数±标准差表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1不同亚型乳腺癌组织中p16基因甲基化及蛋白表达的情况

55例标本中，共12例(21.82%)发生p16基因甲基化。基因甲基化发生率在Luminal A型、Luminal B、HER-2过表达型及基底样型中分别为12.50%(2/16)、21.43%(3/14)、20.00%(3/15)及40.00%(4/10)，其中基底样型基因甲基化发生率显著高于Luminal A型(P<0.05)。

55例标本中，出现p16蛋白阳性21例(38.18%)，p16蛋白在细胞核、细胞浆内呈现不均匀染色，见图1。在Luminal A型、Luminal B、HER-2过表达型及基底样型p16蛋白阳性率分别为50.00%(8/16)、42.86%(6/14)、33.33%(5/15)及20.00(2/10)，其中基底样型p16蛋白阳性率显著低于Luminal A型(P<0.05)。

2.2p16基因甲基化与蛋白表达的关系

12例发生p16基因甲基化的标本中，2例(16.67%)表达p16蛋白，10例(83.33%)未表达；43例未发生基因甲基化的标本中，19例(44.19%)表达p16蛋白，24例(55.81%)未表达。发生基因甲基化与未发生的组织中p16蛋白阳性表达率差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3p16基因甲基化与临床病理特征的关系

分析p16基因甲基化与乳腺癌患者临床病理特征的关系，不同患者年龄、肿瘤直径及PR蛋白表达的组织中p16基因甲基化发生率差异无统计学意义(P>0.05)；组织学分级Ⅱ～Ⅲ级、伴淋巴结转移及ER蛋白表达阴性的组织中甲基化发生率显著高于组织学Ⅰ级、无淋巴结转移及ER蛋白表达阳性的组织(P<0.05)。见表1。

与同一病理特征的另一亚项比较, *P<0.05。

3讨论

乳腺癌的分子发病机制尚未完全明确，其发生发展是一个多基因共同协作的渐进累积过程，表观遗传机制在此过程中发挥重要作用。DNA甲基化作为表观遗传学的重要内容，为乳腺癌的早期诊断与靶向治疗提供了新思路。抑癌基因p16属于周期依赖性激酶抑制因子基因家族，其编码的蛋白可调节细胞周期[9]，阻止DNA损伤的细胞发生分裂和增殖；p16基因信号通路在不同亚型乳腺癌发生发展中可能发挥不同作用[10]。近年来研究[11]表明，p16基因启动子CpG岛甲基化后发生基因沉默，细胞出现生存优势，直接促进肿瘤的发生与发展。

目前，p16基因甲基化在乳腺癌发生发展中的作用报道[12]较多，但大多集中于癌症组织与良性病变组织中甲基化情况的对比；关于不同分子亚型乳腺癌组织中基因甲基化的研究方面，则多集中于SFRP1等其他基因[13]，偶见全基因组甲基化及基因表达概况的研究[14]。本研究检测了55例不同分子亚型乳腺癌组织中p16基因甲基化及蛋白表达情况，结果表明，基底样型乳腺癌组织中p16基因甲基化发生率最高，蛋白表达阳性率最低，提示基底样型乳腺癌组织中p16基因的表达情况较为特殊，p16基因启动子甲基化可能在基底样型乳腺癌发生发展中发挥更为重要的作用。ER、PR蛋白阳性表达的乳腺癌患者对内分泌治疗较为敏感，且预后较好，目前关于这2种蛋白与p16基因甲基化的相关性尚存在争议[8]。本研究进一步分析p16基因甲基化与临床病理特征的关系发现，ER表达阳性患者p16基因甲基化发生率低于阴性患者，提示两者可能存在负相关，与Tao等[15]报道一致；而PR蛋白表达情况与p16基因甲基化无明显相关性，与李莉等[16]报道一致。此外，乳腺癌的组织学分级淋巴结转移情况是判定预后的重要指标，本研究发现，组织学分级为Ⅱ～Ⅲ级，以及伴淋巴结转移的乳腺癌组织中p16基因甲基化的发生率更高，提示p16基因甲基化与病情进展有关，可能成为预测乳腺癌预后的参考指标，与Barekati[17]、聂艳红等[18]报道一致。

综上所述，基底样型乳腺癌组织中p16基因甲基化发生率高于其他分子亚型，蛋白表达率低于其他分子亚型。此外，p16基因甲基化与乳腺癌病情进展密切相关，可能成为预后评估及靶向治疗的参考指标。

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Methylation of p16 gene promoter in different subtypes of breast cancer and its association with p16 protein expression and clinic pathological characteristics

ZHANG Shunli, HU Jiwei, MA Jie, ZHANG Jinghua, WANG Yu,GU Zheng, CHEN Jingjing

(DepartmentofBreastSurgery,TangshanPeople′sHospital,Tangshan,Hebei, 063001)

KEYWORDS:breast carcinoma; basal-like breast carcinoma; p16 gene; methylation

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the methylation of p16 gene promoter in different subtypes of breast cancer and its association with p16 protein expression and clinic pathological characteristics. MethodsMethylation-specific PCR was applied to detect methylation of p16 gene promoter and immune-histochemistry technique was used to detect p16 protein expression in 55 tissue samples of invasive ductal breast cancer. The relationship between methylation of p16 gene promoter and p16 protein expression and clinic pathological characteristics was analyzed. ResultsOut of 55 tissue samples, there were 12 cases (21.82%) with positive outcome in methylation and 21 cases (38.18%) with positive protein expression respectively. The methylation rate of p16 gene promoter was significantly higher and positive expression rate of p16 protein was significantly lower in those diagnosed as basal-like breast carcinoma than those as luminal A subtypes breast carcinoma (P<0.05). The positive expression rate of p16 protein was 16.67% in those with positive methylation and was 44.19% in those with negative methylation (P<0.05). The incidence rate of p16 gene promoter methylation was significantly higher in tissue samples with histological gradeⅡ～Ⅲ, lymph node metastasis, ER-negative than those with histological gradeⅠ, non-lymph node metastasis, ER-positive (P<0.05). ConclusionThe methylation of p16 gene promoter, as an important molecular feature to basal-like breast carcinoma, is potentially associated with disease progression.

收稿日期:2016-03-10

通信作者:张景华, E-mail: JHZH2010@163. com

中图分类号:R 737.9

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2016)11-047-03

DOI:10.7619/jcmp.201611014