香附醋制前后对肝气郁滞模型大鼠的影响

盛菲亚， 周莉江， 严 鑫， 冯五文， 傅超美， 王世宇， 卢君蓉

（成都中医药大学，中药材标准化教育部重点实验室，中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川成都611137）



香附醋制前后对肝气郁滞模型大鼠的影响

盛菲亚， 周莉江， 严 鑫， 冯五文， 傅超美， 王世宇*， 卢君蓉

（成都中医药大学，中药材标准化教育部重点实验室，中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川成都611137）

摘要：目的 建立符合临床病症特点的肝气郁滞大鼠模型，探究香附醋制前后对该大鼠模型的影响。方法 采用慢性不可预见性刺激结合长期皮下注射肾上腺素对大鼠造模；从大鼠体表特征变化、行为学活动和血液流变学3个方面指标评价香附醋制前后“疏肝解郁、活血散瘀”的药效学差异性。结果 给药后，生香附和醋香附各剂量组大鼠各项指标均有所改善（体质量增长逐渐增快，体表瘀斑消散，自发性活动增加，行为灵活性增强，血液黏度减小等），且在同等剂量下，醋香附组整体上各指标优于生香附组。结论 实验结果符合香附“醋制增效”理论，为临床合理用药提供了科学合理的数据参考。

关键词：香附；醋制；疏肝解郁；活血散瘀

香附来源于莎草科植物莎草Cyperus rotundus L.的干燥根茎，其性平，味辛，微苦、微甘，主要具有疏肝解郁、理气宽中、调经止痛的功效［1］，为理气类重点常用中药，被历代医家誉为“气病之总司，女科之主帅”［2］。纵观历代中药炮制著作，香附的常用炮制方法有醋制、制炭、酒制、蜜制、盐制等20余种之多［3］，然而目前临床应用最多，且被《中国药典》2010年版收载的仅有醋香附一种炮制品。《本草蒙筌》中记载香附：“若理气疼，醋炒尤妙。”。香附经醋制以后，可增强其疏肝解郁、活血散瘀之功效，是中药醋制增效理论的代表中药之一。

传统中医理论认为“七情变化，疏泄失职，气机郁结不畅，多责之于肝”，肝气郁滞后，会导致气机失调，血液运行不畅，从而出现血瘀证、郁证等［4-5］。本实验采用慢性不可预见性刺激结合长期皮下注射肾上腺素对大鼠造模，模拟还原临床上肝气瘀滞证致病因素，使所造大鼠模型特征符合临床上常见的肝气瘀滞病症表现。通过大鼠体质量与体表、行为学活动、血液流变学多方面指标的采集，研究香附醋制前后“疏肝解郁、活血化瘀”的药效差异。

1 仪器与材料

1.1 动物 清洁级雌性SD大鼠，体质重（180±10）g，由四川大学华西实验动物中心提供，合格证号SCXK（川）2004-14。

1.2 仪器 LG-R-80A型全血自动血液黏度仪（北京中勤世帝科学仪器有限公司）；KH-300DB型超声仪（昆山禾创超声仪器有限公司）；DGG-9030型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）；D-201型旋转蒸发器（上海申顺生物科技有限公司）；5 m L肝素钠真空采血管（江苏康健医疗用品有限公司）；自制开场箱，100 cm× 100 cm×100 cm，四周及箱底用墨水涂黑，并在箱底用不褪色颜料划分为25 cm×25 cm的方格；自制圆柱形大鼠束缚筒，直径6 cm，高13 cm。

1.3 试药 盐酸肾上腺素注射液（Adr）（上海禾丰制药有限公司，生产批号120608）；疏肝理气丸（南京同仁堂药业有限责任公司，生产批号20121105）；生香附（四川新荷花中药饮片股份有限公司，生产批号1105056）。醋制香附按照课题组前期筛选出的炮制工艺，采用同批生香附制备。

2 实验方法

2.1 模型建立及分组 大鼠适应性饲养3 d后，按体质量分布，均匀地分为9组，每组6只。9组大鼠均在同一条件下饲养。空白组不注射盐酸肾上腺素，不接受慢性不可预见性刺激；其余8组动物均连续20 d背部皮下注射盐酸肾上腺素0.9 mg/kg，并于4 h后接受不可预见性刺激。刺激方法包括：昼夜颠倒12 h +12 h，0～4℃冰水游泳5 min，45℃烘箱热烘10 min，20 Hz超声波刺激30 min，悬尾10 min，束缚2 h，夹尾激怒2 min。每次随机选取1种方法刺激，21 d周期中每种刺激方法各使用3次。

2.2 灌胃药物剂量的确定 根据预实验结果，于第16天开始对阳性组、生香附组（高、中、低剂量共3组）和醋制香附组（高、中、低剂量共3组）共计7组动物给药。阳性组选舒肝理气丸给药，灌胃剂量为用临床等效剂量的10倍量，即1 g/kg；生香附和醋香附的低、中、高剂量组分别按照《中国药典》2010年版规定剂量的10、20、40倍量，即分别按1.78、3.56、7.12 g/kg灌胃给药。空白组和模型组大鼠给予等体积的生理盐水。

2.3 灌胃药物的制备

2.3.1 生香附组 取生香附粗粉100 g，加入600 mL 95％乙醇浸泡12 h，超声20 min后，过滤，滤渣另加600 mL 95％乙醇超声20 min后，过滤，合并两次滤液，45℃水浴下浓缩，95％乙醇定容至10 mL。每次灌胃前，取醇提液适量，与3％的羧甲基纤维素钠（CMC-Na）提液按体积比1∶10研磨混合均匀后，再给予动物灌胃。

2.3.2 醋制香附组 制备方法同“2.3.1”项。

2.3.3 阳性组 每次灌胃前取疏肝理气丸5 g于研钵，加入20 mL的水研磨成质量浓度为0.25 g/mL的均匀混悬液。

2.4 评价指标的采集与检测

2.4.1 体质量 于每日模型组动物皮下注射盐酸肾上腺素前，称量每只大鼠体质量，连续称重21 d。

2.4.2 体表情况 每次称量体质量时注意观察各大鼠耳朵和四肢无毛裸露处颜色变化，及起斑情况，记录出斑时间和消斑时间。

2.4.3 行为学指标 于周期的第21天造模后3 h，进行旷场实验，观察各组大鼠行为学变化。开场箱为100 cm× 100 cm×100 cm，箱子四周及底部均涂黑，箱底用用白线均匀的划分为25个20 cm×20 cm的方格。将每只大鼠分别放入正中方格中，观察其5 min内行动路径，记录各大鼠中心方格停留时间、水平跨格总数和垂直站立次数。水平跨格总数以大鼠四肢完全越过方格的次数为准，垂直站立次数则以前肢离地站立次数为准。整个实验过程中，实验室保持安静，光线自然。

2.4.4 血液流变学指标测定 禁食12 h后，于第22天腹股动脉迅速取血，肝素钠真空采血管采集4 mL血液，轻轻振摇后，在4 h内，使用全自动血液粘度动态分析仪测定各指标。根据试剂盒说明，测定血浆纤维蛋白原（FIB）。

3 实验结果

3.1 体质量测量 根据实验结果（表1）可知，9组大鼠在21 d的周期中均呈不同程度的增长。空白组大鼠体质量以较快的速率保持增长状态，到第21天平均体质量为（279.0±4.02）g。经造模后，其余8组大鼠第15天灌胃前称量体质量为（226.6±3.22）g，各组与空白组比较均具有显著性差异（P＜0.01）。从第16天开始给药后：模型组大鼠体质量仍然保持前期趋势，缓慢增长，第21天平均体质量为（232.4±3.02）g，与空白组比较具有显著性差异（P＜0.01）。生香附组大鼠体质量第21天高、中、低剂量组大鼠体质量分别为（243.0±3.95）、（239.1± 2.99）、（237.3±4.52）g。与模型组比较，生香附高剂量组（P＜0.01）和中剂量组（P＜0.05）具有显著性差异。醋香附组亦呈现出体质量加快增长现象，第21天高、中、低剂量组大鼠平均体质量分别达到（237.3±4.52）、（246.4±3.17）、（242.9±3.41）g。与模型组比较，醋香附中剂量组（P＜0.01）和低剂量（P＜0.01）具有显著性差异。将生香附和醋香附同剂量组比较，醋香附中剂量组和低剂量组结果优于生香附组（P＜0.01）。

表1　大鼠体质量记录表（g，n=6，±s）

表1　大鼠体质量记录表（g，n=6，±s）

注：与空白组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与生香附同剂量组比较，aP＜0.05，aaP＜0.01

组别　　第1天　　第15天　　第21天空白组180.2±2.12 262.1±3.45　 279.0±4.02模型组　179.7±1.98 223.8±3.46ΔΔ232.4±3.02ΔΔ阳性组　181.0±2.05 224.1±3.23ΔΔ250.0±3.85ΔΔ**生香附高剂量组181.5±2.83 221.8±2.95ΔΔ243.0±3.95Δ**生香附中剂量组178.9±1.55 224.0±2.30ΔΔ239.1±3.99Δ*生香附低剂量组180.2±2.48 223.1±2.99ΔΔ237.3±3.43Δ醋香附高剂量组178.3±3.01 221.1±3.15ΔΔ237.3±4.52Δaa醋香附中剂量组179.2±1.80 220.5±2.47ΔΔ246.4±3.17Δ**aa醋香附低剂量组180.7±1.59 222.5±2.68ΔΔ242.9±3.41Δ**aa

3.2 体表变化 整个实验周期中，空白组大鼠皮毛光泽度好、洁白干净，耳朵及四肢呈粉红色，耳朵血管分布正常。其余8组大鼠皮毛均出现皮毛发黄，毛躁无光泽感现象，于造模第7～8天内，耳朵、爪心先后出现瘀斑，但第16天开始给药后，阳性组、醋香附高剂量组和中剂量组、生香附高剂量组大鼠体表瘀斑迅速消散，另醋香附低剂量组、生香附中剂量组和低剂量组瘀斑亦随即消散，除模型组外，给药组共7组大鼠瘀斑均于第17天称重前完全消散。

3.3 旷场实验 根据实验结果可知，长期接受皮下注射肾上腺素及不可预见性刺激造模后，模型组及给药组动物行为学发生了显著改变。实验结果（表2）显示，空白组大鼠在中心格停留时间最短，水平运动次数和垂直运动次数最多，即空白组大鼠活动迅速，肢体灵活，精神好。相反的，模型组大鼠在中心格停留时间最长，水平运动次数和垂直运动次数最少，与空白组大鼠比较，中心格停留时间（P＜0.01），水平运动次数（P＜0.05），垂直运动次数（P＜0.01）均具有显著性差异。而与模型组对比，醋香附组整体较生香附组药效明显，对造模后大鼠的3种行为学指标均有较好的改善，特别是醋香附高剂量组，在中心格停留时间（P＜0.01）、水平运动次数（P＜0.05）和垂直运动次数（P＜0.01）3个方面都与模型组有显著性差异。

表2　大鼠旷场实验结果（n=6，±s）

表2　大鼠旷场实验结果（n=6，±s）

注：与空白组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别　　中心格停留时间/s水平运动次数/次垂直运动次数/次空白组1.33±1.03　 19.17±3.66　 29.83±3.43模型组　36.50±6.80ΔΔ6.00±2.53Δ　9.33±2.42ΔΔ阳性组　3.67±1.21**15.33±2.73　 27.17±4.11**生香附高剂量组4.67±1.86**17.33±4.08　 23.83±3.97*生香附中剂量组5.33±2.16**15.17±4.53　 21.50±2.17**生香附低剂量组16.50±5.54**12.50±3.01　 16.67±2.42醋香附高剂量组4.50±2.26**19.67±3.93*29.50±3.83**醋香附中剂量组4.83±2.48**13.83±3.43　 25.00±3.29**醋香附低剂量组9.50±2.43**13.50±2.81　 19.33±4.32

3.4 血液流变学相关指标

3.4.1 对肝气郁滞大鼠模型全血黏度的影响 经造模后的大鼠，全血切变率1/s和5/s明显增大，模型组与空白组比较有显著性差异（P＜0.01）。与模型组比较，生香附组和醋香附组都能明显改善大鼠全血切变率1/s结果；醋香附高、中剂量组和生香附高剂量组能有效降低全血切变率5/s的值。与生香附组比较，醋香附高剂量组全血切变率1/s（P＜0.05）和全血切变率5/s（P＜0.01）的结果具有显著性差异；醋香附中剂量组全血切变率1/s（P＜0.01）、全血切变率5/s（P＜0.01）和全血切变率200/s（P＜0.01）的结果也具有显著性差异。如表3所示。

表3　香附醋制前后对全血黏度的影响（n=6，±s）

表3　香附醋制前后对全血黏度的影响（n=6，±s）

注：与空白组比较，ΔΔP＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与生香附同剂量组比较，aP＜0.05，aaP＜0.01

组别　　全血切变率1.s-1/ （mPa.s）全血切变率5.s-1/ （mPa.s）全血切变率30.s-1/ （mPa.s）全血切变率200.s-1/ （mPa.s）空白组26.47±2.19　13.39±0.61　8.42±0.72　6.61±0.72模型组　44.42±1.63ΔΔ　18.04±0.41ΔΔ　8.80±0.60　6.47±0.47阳性组　31.39±2.24**　14.42±0.46**　8.49±0.71　6.74±0.46生香附高剂量组　33.86±1.56**　16.55±0.84*　9.36±0.70　6.79±0.53生香附中剂量组　38.36±1.49*　18.17±0.69　10.46±0.81　9.47±0.47生香附低剂量组　38.82±1.65*　18.23±0.34　11.50±0.52　9.64±0.46醋香附高剂量组　28.72±2.04**a　14.32±0.46**aa　8.89±0.27　7.84±0.44醋香附中剂量组　31.90±1.93**aa　16.48±0.46* aa　9.75±0.41　8.12±0.52aa醋香附低剂量组　35.46±1.62**18.81±0.24　12.33±0.29　9.40±0.38

3.4.2 对肝气瘀滞大鼠模型血浆黏度、红细胞聚集指数、纤维蛋白原的影响 经造模后的大鼠，其血浆黏度、红细胞聚集指数、纤维蛋白原均明显增大，模型组与空白组大鼠比较有显著性差异（P＜0.01）。与模型组比较，生香附高剂量组和醋香附组能显著降低血浆黏度；生香附高、中剂量组和醋香附组能明显改善红细胞聚集指数，而生香附和醋香附各剂量组均能明显地降低造模后大鼠的纤维蛋白原值（P＜0.01）。生香附和醋香附同剂量组比较，两个高剂量组血浆黏度（P＜0.05）、红细胞聚集指数（P＜0.01）和纤维蛋白原（P＜0.01）的结果具有显著性差异；两个中剂量组血浆黏度（P＜0.01）、红细胞聚集指数（P＜0.01）和纤维蛋白原（P＜0.01）的结果具有显著性差异；2个低剂量组血浆黏度（P＜0.01）和纤维蛋白原（P＜0.01）的结果也具有显著性差异。如表4所示。

表4 香附醋制前后对大鼠血浆黏度、红细胞聚集指数、纤维蛋白原的影响（n=6，±s）

表4 香附醋制前后对大鼠血浆黏度、红细胞聚集指数、纤维蛋白原的影响（n=6，±s）

注：与空白组比较，ΔΔP＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与生香附同剂量组比较，aP＜0.05，aaP＜0.01

组别　　血浆黏度/ （mPa.s）红细胞聚集指数纤维蛋白原/ （g.L-1）空白组1.54±0.04　 4.11±0.14　 2.32±0.08模型组　1.86±0.09ΔΔ6.78±0.30ΔΔ　4.62±0.14ΔΔ阳性组　1.59±0.05**4.56±0.28**　3.07±0.10**生香附高剂量组1.67±0.03**5.80±0.17*　3.63±0.09**生香附中剂量组1.80±0.04　 5.82±0.23*　3.59±0.43**生香附低剂量组1.89±0.11　 6.22±0.33　 3.55±0.65**醋香附高剂量组1.57±0.04**a4.24±0.18**aa3.09±0.10**aa醋香附中剂量组1.62±0.03**aa5.10±0.17**aa4.05±0.08**aa醋香附低剂量组1.73±0.05*aa5.63±1.36*　4.34±0.05**aa

4 讨论

据《中国药典》2010版一部载录，以香附为主要原料的成方制剂多数打粉后入丸制剂，如香附丸、良附丸［1］等，其目的为尽可能保留其中对高温不稳定的成分—挥发油部位成分。

挥发油是香附的主要药效部位之一，其中主要成分多属于低极性类化合物，药效十分明确。现代药理研究表明［6-8］，香附挥发油能协同戊巴比妥钠起到催眠作用，对家兔具有一定的麻醉效果，可协同东莨菪碱的麻醉正常家兔，可降低大鼠体温，抑制离体肠管的收缩，稳定血压，抗炎抗菌和雌激素样作用。此类药效作用在一定程度上符合对香附“疏肝解郁，调经止痛”功效的描述。然而，香附挥发油对消化道具有一定的刺激性，且收集过程影响因素较多，所以不适合直接用于灌胃。基于此，课题组采用乙醇作为溶媒，有利于香附中药效成分的充分溶出；采用超声法提取灌胃药液，可避免高温对香附药效成分质和量的影响；最后采用CMC-Na稀释药液，可降低高浓度的药液对大鼠消化道的刺激性，准确控制灌胃剂量。

中医理论认为情志与“肝”关系最为密切［9］，若情志不舒，或外邪侵袭则易引起肝气久郁不解，使肝气疏泄不利，气机运行不畅，条达失宜而气血紊乱，以致血液运行障碍，形成气滞血瘀病症。为尽可能模拟和贴近肝气瘀滞证发病原因和主要病症［10-11］，本课题组采用皮下注射盐酸肾上腺素，使大鼠交感神经兴奋，模拟人体暴怒时激素分泌情况；采用昼夜颠倒、冰水游泳、高温、夹尾打斗、超声波、悬尾、束缚多种方法模拟外邪侵扰和情志不畅，从而达到“怒伤肝，久则郁”之效。实验模型组大鼠体质量增重缓慢、行为迟缓、血液黏度增大、纤维蛋白原增多等，与临床上病患出现的体质量减轻、寡言少欢、血瘀痛经等症状相吻合。因此我们认为，相比在短时间内重复皮下注射肾上腺素和冰水浴刺激的急性气滞血瘀证动物模型，本课题组造模过程和结果更加贴合临床发病原理和病症特点，更加适合用于如香附等疏肝解郁类药物的药理药效学实验研究。

经造模后，实验大鼠体质量增长减缓，出现大便粘连、稀溏的现象，并且随着造模时间的延长，这类现象十分明显。《血证论》中说“木之性主于疏泄，食气入胃，全赖肝木之气以疏泄之，而水谷乃化，设肝不能疏泄水谷，渗泄中满之证，在所不免”［12］。肝失疏泄，气机失调，从而影响脾胃消化，即临床常见的“肝气犯胃”和“肝脾不和”。大鼠行为学实验中，模型组大鼠行为懒倦、活动迟缓、神色呆滞。“神”倚靠精、气、血为基础而体现人的情志活动，气机失调、血行不畅则导致情志抑郁不舒，而引起寡言少欢、急躁易怒等。血液流变学结果指出造模后的大鼠血液切变率升高，血浆黏度增大，纤维蛋白原增多。《素问.五藏生成篇》中王冰注曰“气行则血流”。中医论情志不遂，郁怒紧张，肝失疏泄，气血逆乱，气血运行受阻而成血瘀气滞。临床上红细胞流变特异性变化、血液高黏高凝状态及流动性质的改变是血瘀证重要的客观指标［13］。由此可见，实验模型大鼠指标数据的特征与中医理论下肝气瘀滞证表现一致。

《中国药典》2010版中载香附疏肝解郁，理气宽中，用于肝郁气滞，脾胃气滞，月经不调等［1］。醋味酸，入肝经，以醋为辅料炮制后可“引药入肝”［14］。从实验结果可知，一定剂量的生香附和醋香附对肝气瘀滞证模型大鼠均具有治疗作用。然而从整体实验结果来看，在同等剂量下，醋香附给药组大鼠比生香附组给药组大鼠体质量增重更快，体表瘀斑消散更早，活动更灵活、血液流变学相对更接近空白组大鼠水平。因此，本实验在验证香附良好的“疏肝解郁，理气宽中”功效的同时也从药效学角度阐述了香附“醋制增效”理论的科学内涵，为临床合理用药提供了一定的依据和参考。

本实验通过对比体质量、体表变化、行为学活动和血液流变学方面的指标探讨了香附醋制前后其理气、解郁、活血功效差异，而香附的疏肝、调经功效并未能同时以实验数据直接说明，而未能完全比较出醋制对香附主治功能的差异。由此，在本实验的基础上，课题组拟在下一步实验中通过增加肝脏超氧化物歧化酶（SOD）、脂质过氧化物丙二醛（MDA）等生化指标，以及雌鼠长期阴道涂片观测等手段，进一步说明香附的“醋制增效”的科学内涵。

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*通信作者：王世宇（1974—），女，副教授，研究方向为临床中药学。Te1：（028）61800231，E-mai1：wangshiyu@edutcm.edu.cn

作者简介：盛菲亚（1988—），女，硕士生，主要从事中药新制剂与新剂型研究。Te1：15363717902，E-mai1：sophia880728@126.com

基金项目：国家自然科学基金项目（81303227）

收稿日期：2014-08-18

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.035

中图分类号：R285.5

文献标志码：B

文章编号：1001-1528（2016）01-0156-04