HPLC-ELSD法同时测定不同产地白果药材中4种萜内酯类成分

张群群， 李慧芬，2， 张学兰，2*， 吴 鹏， 王均秀， 宋梦晗， 赵 鑫

（1.山东中医药大学，山东济南250355；2.国家中医药管理局中药炮制传承基地，山东济南250355）



HPLC-ELSD法同时测定不同产地白果药材中4种萜内酯类成分

张群群1， 李慧芬1，2， 张学兰1，2*， 吴 鹏1， 王均秀1， 宋梦晗1， 赵 鑫1

（1.山东中医药大学，山东济南250355；2.国家中医药管理局中药炮制传承基地，山东济南250355）

摘要：目的 建立HPLC-ELSD法同时测定白果药材中白果内酯和银杏内酯A、B、C。方法 白果乙酸乙酯萃取物的分析采用Kromasi1C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.1％甲酸水（38∶62）；柱温30℃，体积流量0.8 mL/min。结果 白果内酯和银杏内酯A、B、C分别在1.01～40.40 μg、1.03～41.20 μg、2.37～94.80 μg、1.51～60.40 μg范围内线性关系良好（r＞0.999 5），平均回收率在97.3％～99.2％之间。5个不同产地（山东济南、临沂、泰安，广西桂林和江苏泰兴）白果药材中四者的含有量分别为75.55～219.73、54.79～135.88、200.37～853.39、119.31～498.06 μg/g。结论 白果中4种萜内酯类成分的总含有量以江苏省泰兴市产者为最高。

关键词：白果；白果内酯；银杏内酯A；银杏内酯B；银杏内酯C；产地；HPLC-ELSD

白果为银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的干燥成熟种子，其味甘、苦、涩，性平，有毒，具有敛肺定喘、止带缩尿的功能［1］，含有银杏酸、萜内酯、黄酮等成分［2-3］，其中萜内酯类化合物有银杏内酯A、B、C和白果内酯等［4-5］。研究表明，银杏酚酸类成分具有致敏性、细胞毒性和免疫毒性，为白果的主要毒性成分［6］；白果萜内酯是血小板活化因子的拮抗剂，对心脑血管疾病具有独特的药理作用，广泛用于治疗和预防心脑血管疾病［7］；白果内酯具有提高痴呆小鼠的学习记忆功能和抗卡氏肺孢子虫肺炎作用［8-9］。关于白果药材的质量标准，《中国药典》2010年版一部仅收载了成品的外观性状、粉末的显微特征及薄层色谱的定性鉴别，缺乏有效成分或指标成分的含有量测定指标和参数，难以控制白果药材的质量。李转梅等［10］建立了白果药材及炮制品中白果酸和总银杏酸含有量的测定方法，罗曼等［11］建立了白果仁萜内酯类成分的HPLC-ELSD指纹图谱定性分析方法，但未见对白果中萜类内酯成分定量测定的相关报道。目前，银杏叶及其制剂中该类成分的定量测定方法有HPLC-ELSD、HPLCMS/MS、UPLC-TQ-MS等［12-14］。本实验建立了HPLC-ELSD同时测定白果药材中白果内酯和银杏内酯A、B、C的方法，并测定了5个不同产地、批次白果药材中这些成分的含有量，可为其质量控制和评价提供科学依据。

1 仪器与试药

Waters e2695型HPLC色谱仪、e2424型蒸发光散射检测器（美国Waters公司）；FA1604N型电子天平（十万分之一，上海精密科学仪器有限公司）；KQ-250E型医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C对照品（中国食品药品检定研究院，供含有量测定用，批号分别为110865-200605、110862-200608、110863-200508、110864-200906）。HPLC用甲醇为色谱纯；水为娃哈哈纯净水；其他试剂均为分析纯。

白果药材的产地分别为山东省济南市长清区、临沂市、泰安市、广西省桂林市、江苏省泰兴市，经山东中医药大学中药鉴定教研室李峰教授鉴定为银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的成熟种子。除去杂质，50℃下烘干，备用。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的制备 分别精密称取白果内酯5.05 mg、银杏内酯A 5.15 mg、银杏内酯B 4.74 mg、银杏内酯C 3.02 mg，置于1 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为对照品溶液。分别吸取四种对照品溶液0.2、0.2、0.5、0.5 mL，置于同一2 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含白果内酯0.505 mg、银杏内酯A 0.515 mg、银杏内酯B 1.185 mg、银杏内酯C 0.755 mg的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备 精密称取各样品粉末（过3号筛）5 g，分别置于索氏提取器中，加甲醇80 mL，水浴回流提取6 h至无色，减压回收甲醇蒸干，残渣加水20 mL，70℃水浴温热使其溶解。再往里加2％稀盐酸溶液2滴，乙酸乙酯萃取3次（15、10、10 mL），合并提取液，5％乙酸钠溶液20 mL洗涤，洗液再用乙酸乙酯10 mL洗涤，合并乙酸乙酯液及洗液，纯水洗涤2次，每次20 mL，合并水洗液，10 mL乙酸乙酯洗涤，合并乙酸乙酯液，回收至干，残渣用甲醇溶解，转移至1 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 色谱条件 Kromasi1C18色谱柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.1％甲酸水（38∶62）；柱温30℃；体积流量0.8 mL/min；蒸发光检测器的漂移管温度60℃；载气流量25 L/min。在上述条件下，白果内酯和银杏内酯A、B、C与其他成分均可达到基线分离，见图1。

1.白果内酯 2.银杏内酯C 3.银杏内酯A 4.银杏内酯B1.bi1oba1ide 2.ginkgo1ide C 3.ginkgo1ide A 4.ginkgo1ide B图1　混合对照品与白果药材的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram s of m ixed reference substances and Ginkgo Semen sam ples

2.4 线性关系考察 分别精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液2、10、20、40、80 μL，注入HPLC色谱仪，在“2.3”项色谱条件下进行测定，记录色谱峰峰面积，以进样量（μg）对数为横坐标（X），峰面积对数为纵坐标（Y）进行线性回归，计算回归方程。结果，各成分线性关系良好，见表1。

表1　4种内酯类成分的线性关系Tab.1 Linear relationships of four terpene lactones

2.5 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液（山东省济南市长清区）10 μL，注入HPLC色谱仪，连续进样6次，测定白果内酯和银杏内酯A、B、C的峰面积。结果，RSD分别为1.5％、1.5％、1.5％和1.8％，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液（山东省济南市长清区）适量，室温下分别在0、2、4、8、12、24 h进样10 μL，测定白果内酯和银杏内酯A、B、C的峰面积。结果，RSD分别为1.6％、1.3％、1.9％、1.8％，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验 精密称取同一产地白果药材粉末（山东省济南市长清区，过3号筛）6份，每份5 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，在“2.3”项色谱条件下测定，计算白果内酯和银杏内酯A、B、C的含有量。结果，四种成分的平均含有量分别为80、57、204、141 μg/g，RSD分别为1.1％、1.9％、1.9％、2.5％，表明该方法重复性较好。

2.8 加样回收率试验 精密称取含有量已知的白果药材（山东省济南市长清区，过3号筛）6份，每份2.5 g，精密加入白果内酯（0.019 51 g/L）、银杏内酯A（0.013 26 g/L）、银杏内酯B （0.050 92 g/L）、银杏内酯C（0.034 51 g/L）对照品溶液1 mL，甲醇补足至80 mL，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，在“2.3”项色谱条件下测定，结果见表2。

2.9 样品测定 精密吸取混合对照品和供试品溶液各10 μL，注入HPLC色谱仪进行分析测定，计算样品中4种内酯类成分的含有量，结果见表3。

3 小结与讨论

白果萜内酯类成分在紫外末端有吸收，HPLCUV测定时灵敏度低，杂质干扰大，重复性差。本实验首次建立了HPLC-ELSD法同时定量测定不同产地白果药材中白果内酯和银杏内酯A、B、C的含有量，对提取溶剂50％、70％、100％甲醇进行比较，发现以甲醇为溶剂提取的4种萜内酯成分总含有量最高；对甲醇索式回流6 h和甲醇超声1 h进行比较，发现前者提取效果较好，而且色谱峰峰形理想，同时还对流动相等参数进行了考察。综上所述，该方法简便、可靠、有效，可用于白果药材中白果内酯和银杏内酯A、B、C成分的测定，为其质量控制提供一定参考。

不同产地、批次白果药材中白果内酯和银杏内酯A、B、C成分的含有量相差较大，四者总含有量最高者是最低者的4倍。因此，建议将这4种成分的含有量限度纳入白果药材质量标准中，以期更全面地控制其质量。

由于白果中内酯类成分的含有量较低，测定时取样量大，而且甲醇提取液中含有较多色素等杂质，干扰测定，对仪器损害严重，故需作进一步纯化。本实验采用乙酸乙酯萃取法，将四种萜内酯类成分充分转移到乙酸乙酯中，可排除色谱测定时杂质的干扰，而且它们与其他成分分离度良好。

表2　加样回收率试验结果（n=6）Tab.2 Resu lts of recovery tests（n=6）

表3　4种萜内酯成分含有量的测定结果（μg/g，n=2）Tab.3 Determ ination results of the contents of four terpene lactones（μg/g，n=2）

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Simultaneous determ ination of four terpene lactones in Ginkgo Semen from dif-

ferent grow ing areas by HPLC-ELSD

ZHANG Qun-qun1， LI Hui-fen1，2， ZHANG Xue-1an1，2*， WU Peng1， WANG Jun-xiu1， SONG Meng-han1， ZHAO Xin1
（1.Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 25O355，China；2.Traditional Chinese Medicine Processing Technology Helitage Base，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Jinan 25O355，China）

ABSTRACT：AIM To estab1ish amethod for simu1taneous1y determining the contents of bi1oba1ide and ginkgo1-ide A，B，C in Ginkgo Semen by HPLC-ELSD.METHODS The ana1ysis of Ginkgo Semen ethy1acetate extract was performed on Kromasi1C18co1umn（250 mm×4.6 mm，5 μm），mobi1e phasewasmethano1-0.1％ methanoic acid water（38∶62），co1umn temperature wasmaintained at30℃，and f1ow rate was 0.8 mL/min.RESULTS Bi1oba1ide and ginkgo1ide A，B，C had good 1inear re1ationships in the ranges of 1.01 -40.40 μg，1.03 -41.20 μg，2.37 -94.80 μg and 1.51 -60.40 μg，respective1y（r＞0.999 5）.Their average recoveries were 97.3％ -99.2％.The contents of these four consitituents in Ginkgo Semen from five different growing areas（Jinan，Linyi，Taian in Shandong，Gui1in in Guangxi and Taixing in Jiangsu）were 75.55 -219.73 μg/g，54.79 -135.88 μg/g，200.37 -853.39 μg/g and 119.31 -498.06 μg/g，respective1y.CONCLUSION The tota1 contents of four terpene 1actones in Ginkgo Semen is the highest in Taixing（Jiangsu）.

KEY WORDS：Ginkgo Semen；bi1oba1ide；ginkgo1ide A；ginkgo1ide B；ginkgo1ide C；growing areas；HPLC-ELSD

*通信作者：张学兰（1963—），女，教授，从事中药新药研发与中药炮制原理研究。Te1：（0531）89628081，E-mai1：zhang8832440@sina.com

作者简介：张群群（1988—），女，硕士，从事中药新药研发与中药炮制原理研究。Te1：18753151090，E-mai1：zhangqunqun01@163.com

基金项目：济南市高校自主创新计划项目（201303027）

收稿日期：2015-07-13

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.030

中图分类号：R284.1

文献标志码：A

文章编号：1001-1528（2016）01-0133-04