陈氏内异丸对子宫内膜异位症大鼠黏附、侵袭病理机制影响的探讨*

邬素珍，赵春梅，聂润球

(佛山市禅城区中心医院妇科，广东佛山 528000)

陈氏内异丸对子宫内膜异位症大鼠黏附、侵袭病理机制影响的探讨*

邬素珍，赵春梅，聂润球

(佛山市禅城区中心医院妇科，广东佛山 528000)

目的:观察陈氏内异丸对子宫内膜异位症(EMs)大鼠血清可溶性细胞间黏附分子-1(sICAM-1)浓度和异位内膜基质金属蛋白酶-3(MMP-3)表达的影响。方法:建立大鼠EMs模型，按随机数字表法分为陈氏内异丸高、中、低剂量组和丹那唑、模型对照、假手术组，末次给药1周后采血检测。结果:陈氏内异丸能有效降低EMs大鼠血清sICAM-1浓度，抑制异位内膜组织MMP-3的阳性表达。结论:抑制异位内膜的黏附、侵袭最终抑制EMs的发展，可能是陈氏内异丸治疗EMs的作用机理之一。

子宫内膜异位症;陈氏内异丸;大鼠;黏附分子-1;基质金属蛋白酶-3

子宫内膜异位症(EMs)是具有侵袭性的良性病变，体外研究表明，脱落的子宫内膜细胞于24 h之内即黏附于腹膜上，进一步发生种植、侵袭形成异位病灶［1］。可溶性细胞间黏附分子(sICAM)和基质金属蛋白酶(MMPs)是与细胞黏附、侵袭性生长机制密切相关的2种因子。本研究以丹那唑和蒸馏水为对照，观察陈氏内异丸对EMs大鼠血清sICAM-1浓度和异位内膜MMP-3表达水平的影响，探讨其治疗EMs的作用机理。

1 材料与方法

1.1 动物

健康、未孕成熟的清洁级雌性SD大鼠120只，鼠龄60～80 d，体质量200～250 g，购自广州中医药大学动物实验中心(许可证号 SCXK(粤)2008-0020)。

1.2 药物

陈氏内异丸由佛山市中医院制剂中心提供(粤药制字Z03140215)，临用前磨碎，将陈氏内异丸与蒸馏水分别配制成浓度为0.72 g/mL高剂量、0.36 g/mL中剂量、0.18 g/mL低剂量3种剂量的陈氏内异丸溶液。丹那唑胶囊由江苏联环药业股份有限公司生产(国药准字H20023116)，将丹那唑胶囊内容物与蒸馏水制成浓度为3.6 mg/mL的丹那唑混悬液，蒸馏水由佛山市中医院制剂中心提供(批准文号277179)。

1.3 主要试剂与仪器

石蜡切片机(德国 LEICA)，包埋机(日本樱花)，脱水机(英国三顿)，光学显微镜(日本Olympus)，显微照相仪(尼康)，MMP-3相关免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司生产。大鼠血清sICAM酶免试剂盒由大连泛邦技术开发有限公司进口分装。

1.4 EMs大鼠模型建立

参照雷红［2］造模方法，本实验造模成功率为62%。

1.4.1 造模 于大鼠动情期进行手术，以1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔内注射麻醉，麻醉满意后备皮;下腹正中纵行切口1.5 cm，逐层开腹找到左侧宫角，剪下一段长约1 cm子宫体;揭除浆膜及大部分肌层，将黏膜切割成5×5 mm2的组织;将切割好的子宫黏膜面向下覆盖腹壁表面，以“6-0”可吸收线于四角缝合固定在腹壁黏膜上;腹腔内注入8×103u庆大霉素后逐层关腹;术后连续3 d肌注庆大霉素0.4万U预防感染，并用碘伏消毒伤口，继常规饲养4周。假手术组动物模型制作:麻醉、备皮方法同上，剖腹后关腹，术后处理同上。

1.4.2 二次剖腹探查 造模术后4周将大鼠逐一进行二次剖腹，探查造模情况。按前法麻醉、备皮、剖腹，检查腹壁子宫内膜移植物是否成活。观察移植物体积增大，出现液体积聚、移植物被结缔组织或大网膜覆盖并有血管生成，部分移植物成黄色或褐色小结为造模成功。取4只肉眼证实造模成功的大鼠内异病灶组织，以体积分数10%福尔马林固定送检病理，证实移植物中有子宫内膜上皮细胞、腺体及间质的生长并有分泌活动，说明造模成功。假手术组二次剖腹探查时仅行开关腹术。

1.5 分组及给药 二次剖腹探查后4周，取造模成功大鼠50只按随机数字表法分为5组各10只，分别为陈氏内异丸中药高、中、低剂量组和丹那唑组及模型组。本实验低剂量组用药相当于成人常规口服剂量。高、中、低剂量组按7.2、3.6、1.8 g· kg－1·d－1剂量给药，丹那唑组按36 mg·kg－1·d－1剂量给药，模型组和假手术组给予相同容积20 ml的蒸馏水，连续给药4周。

1.6 标本提取

在末次给药1周后抽内眦静脉血2 ml，1000 r/ min离心10 min后取上清液，－20℃冰箱保存备检;进行第3次剖腹手术，剥取EMs大鼠内异病灶组织，以体积分数10%甲醛固定，以备检测MMP-3在大鼠异位内膜的表达。

1.7 MMP-3表达结果判定

子宫内膜腺上皮细胞胞质中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性染色。参照 Terry的标准［4］进行评分，即以阳性细胞百分率及显色深浅的半定量评分值的和为最终评分标准:阳性细胞百分率评分:无细胞显色为0;＜25%细胞显色为1;25%～50%细胞显色为2;＞50%细胞显色为3;显色深浅评分:不显色或显色不清为0;浅黄色为1;棕黄色为2;深褐色为3。2项评分相加为染色强度:0～1分为阴性(－)，2分为弱阳性(+)，3～4分为中度阳性(++)，5～6分为强阳性(+++)。

1.8 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，用单因素方差分析对数据进行统计分析。

2 结果

2.1 一般资料

灌胃过程中共死亡7只，总死亡率为11.86%;其中中药高剂量组死亡3只，中剂量组死亡1只，低剂量组死亡1只，丹那唑组死亡2只。

2.2 血清sICAM-1结果

表1显示，治疗后陈氏内异丸各剂量组及丹那唑组血清sICAM-1浓度明显低于模型组，差异有统计学意义;陈氏内异丸高、中剂量组血清sICAM-1浓度较丹那唑组低，差异有统计学意义;陈氏内异丸各剂量组血清sICAM-1浓度与假手术组比较差异无统计学意义。

表1 治疗后各组sICAM-1比较(±s，ng/ml)

表1 治疗后各组sICAM-1比较(±s，ng/ml)

注:与模型组比较:＊P＜0.001，与丹那唑组比较:#P＜0.01，与丹那唑组比较:△P＜0.05

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2.3 MMP-3表达结果

表2图1～6显示，假手术组子宫内膜腺上皮细胞呈阴性表达，模型组异位内膜腺上皮细胞呈强阳性表达;中药高、中剂量组及丹那唑组异位内膜腺上皮细胞呈阴性表达;中药低剂量组异位内膜腺上皮细胞呈弱阳性表达。

表2 各组大鼠治疗后异位内膜组织MMP-3表达结果

表2显示，陈氏内异丸高、中剂量组及丹那唑组阳性强度低于模型组，差异有统计学意义;但低剂量组阳性强度与模型对照组相当，差异无统计学意义;高、中剂量组阳性强度与丹那唑组相当，差异无统计学意义。

图1 假手术组子宫内膜(×200)

图2 模型组异位内膜(×200)

图3 高剂量组异位内膜(×200)

图4 中剂量组异位内膜(×200)

图5 低剂量组异位内膜(×200)

图6 丹那唑组异位内膜(×200)

3 讨论

EMs自1860年首次发现至今其发病机制仍不清楚。目前各种发病机制中“种植学说”仍为主要学说之一。研究表明，子宫内膜细胞在异位种植生长时，必须具备“3A模式”，即黏附(Attachment)、侵袭(Aggression)和血管生成(Angiogenesis)3个基本环节［3-5］，以此完成逆流内膜细胞在盆腹腔腹膜、器官和组织的种植、生长，从而形成内异病灶。

子宫内膜成功在异位种植的首要步骤是通过一系列位于细胞表面的细胞黏附分子及与黏附相关的途径所介导的内膜细胞与种植部位的黏附［6］。闫桂英等［7］检测到异位灶组织ICAM-1表达明显高于其在位内膜和对照组。另有研究者认为，内膜间质细胞表面脱落的ICAM-1在异位内膜种植初期，在异位病灶逃避免疫监视中起重要作用［8］。Matalliotakis等［9］发现，内异症患者的血清可溶性ICAM-1浓度高于正常者。Daniel等［10］也发现，中度到重度的内异症患者血浆和腹腔液中ICAM-1明显升高。

基质金属蛋白酶(MMPs)是降解细胞外基质的最重要因子，MMP-3在MMPs中尤为重要，它以酶原的形式释放，由纤溶酶激活，不仅能够降解细胞外基质，更重要的是能激活其他MMPs的酶原形式。Cox［11］在异位症动物实验模型中发现，异位病灶中MMP-3呈过度表达，从而认为MMP-3参与组织的侵袭和重建，促进异位症的发生发展。因此，异位内膜组织中MMP-3的高表达，可能赋予异位内膜特有的侵袭和种植的能力，是EMs发病的重要机制之一。

由此可见，血清sICAM-1浓度的高低及异位病灶MMP-3表达的强度可反映EMs发生发展“3A”过程的活跃程度。

中医药在治疗子宫内膜异位症方面取得了显著疗效［12］。陈氏内异丸是佛山市中医院具有40多年临床经验的中西医结合妇科专家陈秀廉献方生产的中成药，已在临床使用20多年，以活血化瘀、软坚散结、理气止痛、补肾固本立论组方，全方重在活血化瘀消癥。陈氏内异丸的前期临床研究表明［13-14］，其治疗EMs有明显的临床疗效，能显著改善EMs患者痛经、腰骶部不适、直肠刺激症等症状。

本研究旨在进一步探讨陈氏内异丸对EMs的作用机制，结果显示陈氏内异丸能有效降低EMs模型大鼠的血sICAM-1浓度，并能降至正常水平，高、中剂量组疗效优于丹那唑组(高剂量组P＜0.01，中剂量组P＜0.05);陈氏内异丸高、中剂量组能有效抑制异位病灶MMP-3的阳性表达，且与丹那唑组比较疗效相当。

综上表明，陈氏内异丸能明显降低EMs大鼠血sICAM-1浓度，并能抑制 EMs大鼠异位病灶中MMP-3的阳性表达，高、中剂量组疗效尤其显著。因此，陈氏内异丸可降低异位病灶活性并有效治疗EMs，其作用机制可能与通过免疫调节、抑制异位内膜的黏附、侵袭、种植而达到清除异位病灶的作用有重要的关系。这一实验结果为临床使用陈氏内异丸治疗EMs提供了有力的依据。

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Investigation of Chenshi Neiyi Pill to the Adhesion，Invasion and Pathological Mechanism of Endometriosis Rats

WU Su-zhen，ZHAO Chun-mei，NIE Run-qiu
(Chancheng District Central Hospital of Foshan city，Foshan，Guangdong 528000，China)

Objective:To evaluate the effect of NeiYi Pill of Chen by the ICAM-1 concentration and expression of MMP-3 on endometriosis model in rats．Methods:To establish endometriosis model in rats．Results:NeiYi Pill of Chen can decrease the ICAM-1 concentration of endometriosis model in rats effectively．Conclusion:Inhibiting the adhesion and invasion of ectopic endometrium，eventually inhibiting the EMS development，may be one of NeiYi Pill of Chen theatment EMS mechanism of action．

Endometriosis;NeiYi Pill of chen;Rat;ICAM-1;MMP-3

R285．5

B

1006-3250(2016)01-0073-03

2015-04-16

广东省中医药管理局基金项目(1060007)-陈氏内异丸对子宫内膜异位症作用机制的实验研究

邬素珍(1965-)，女，广东兴宁人，主任医师，教授，医学学士，硕士研究生导师，从事子宫内膜异位症、不孕症的临床与研究。