绿色丝胶蛋白质功能特性研究

叶崇军 耿 齐 李 冰 陈复生

(1安徽省农业科学院蚕桑研究所，安徽合肥 230061; 2南京苏豪丝绸文化发展有限公司，江苏南京 210005)

绿色丝胶蛋白质功能特性研究

叶崇军1耿 齐2李 冰1陈复生1

(1安徽省农业科学院蚕桑研究所，安徽合肥 230061;2南京苏豪丝绸文化发展有限公司，江苏南京 210005)

以选配的纯丝胶蚕品种组合(绿S、白S)生产的全天然绿色纯丝胶蚕茧、白色纯丝胶蚕茧以及现行蚕品种菁松×皓月(JS)生产的白色普通蚕茧、远缘杂交的蚕品种生产的黄色普通蚕茧、远缘杂交的蚕品种生产的白色普通蚕茧为材料，对绿色丝胶蛋白质的部分功能特性进行了研究。试验结果表明，绿S蚕茧的丝胶蛋白质抗氧化能力最强;在丝胶蛋白浓度为1 mg/mL时，绿S蚕茧的丝胶蛋白质比JS蚕茧的丝胶蛋白质对大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、米曲霉、黑曲霉的抑菌圈直径分别大2.5、3.1、1.5、1.7、2.3、1.5 mm;在315～500 nm的波域内，绿S蚕茧的丝胶蛋白质仍然具有较强的紫外吸收能力，表明其具有更为优异的抗氧化、抗菌、紫外线遮蔽等功能特性，该结果为绿色丝胶蛋白在化妆品、保健品、医药等领域的创新产品研发提供了依据。

丝胶蛋白质;纯丝胶蚕茧;抗氧化性;抗菌性能;紫外吸收光谱;功能特性

丝胶蛋白质为水溶性球状蛋白质，是化妆、保健、医药等领域的创新产品研发的优良材料，其利用的价值在于具有诸多独特的、有用的功能特性［1］。

蚕茧颜色由桑叶中的胡萝卜色素和类黄酮色素决定［2］。桑叶中含有的类黄酮色素在蚕体内透过肠壁并运输到肠腔细胞、体液、丝腺细胞，在丝腺中分泌合成有色丝胶蛋白质，形成彩色蚕茧，家蚕茧丝的色泽多由丝胶蛋白质的色泽决定［3］。我们以选配的纯丝胶蚕品种组合所生产的天然绿色纯丝胶蚕茧为材料，对有色丝胶蛋白质的部分功能特性开展研究，旨在为应用有色丝胶蛋白质在化妆、保健、医药等领域的创新产品研发提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验仪器 LGJ－12型冷冻真空干燥仪，北京松源华兴科技发展有限公司产品;氨基酸自动分析检测仪，德国SYKAM公司产品;UV－1201型紫外荧光光度计，北京北分瑞利分析仪器公司产品;Re－52型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂产品;SYQ· STX－280型手提式高压蒸汽消毒锅，杭州华创科学仪器有限公司产品;HG101－2型电热鼓风干燥箱，苏州贯觉电热设备有限公司产品;PYX－DHS－40× 50型隔水式电热恒温培养箱，杭州汇尔仪器有限公司产品;PB602N型电子天平，上海菁海仪器有限公司产品;ZH－WY－111B型恒温培养摇床，金坛市精达仪器制造有限公司产品。

1.1.2 试验试剂 邻苯三酚、水杨酸乙醇，均为分析纯(AR)，国药集团化学试剂有限公司产品;风味蛋白酶，分析纯(AR)，上海生工生物工程股份有限公司产品。

1.1.3 供试蚕茧 从日本引进的纯丝胶种质资源与绿色蚕茧蚕品种组配的品种组合(绿S)生产的绿色纯丝胶蚕茧，从日本引进的纯丝胶种质资源与白色蚕茧蚕品种组配的品种组合(白S)生产的白色纯丝胶蚕茧，现行生产用蚕品种菁松×皓月(JS)生产的白色普通蚕茧，远缘杂交的蚕品种生产的黄色普通蚕茧，远缘杂交的蚕品种生产的白色普通蚕茧(远缘杂交普通黄色茧、远缘杂交普通白色茧是以安徽省农业科学院蚕桑研究所桑园野蚕与家蚕品种“若玉”杂交所选育品系生产的蚕茧)，均由安徽省农业科学院蚕桑研究所提供。

1.1.4 供试菌种 大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、米曲霉、黑曲霉均由上海大学生命科学学院食品科学系提供。

1.1.5 供试培养基 大肠杆菌培养基、枯草杆菌培养基、金黄色葡萄球菌培养基、酵母菌培养基、米曲霉培养基、黑曲霉培养基，均为广东环凯微生物科技有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 不同品种蚕茧茧壳丝胶蛋白样品的制备将绿S蚕茧和白S蚕茧用手撕剥离茧壳倒出蚕蛹，JS蚕茧、远缘杂交普通黄色茧、远缘杂交普通白色茧用削茧刀削茧倒出蚕蛹，分别去除粘附在5种蚕茧上的赃物，然后用30℃水分别洗涤倒出蚕蛹后的5种蚕茧茧壳，洗涤后的5种蚕茧茧壳分别于60℃烘干5 min，然后分别剪成2 mm×2 mm的蚕茧茧壳碎片。分别称取5 g绿S蚕茧、白S蚕茧和JS蚕茧、远缘杂交普通黄色蚕茧和远缘杂交普通白色蚕茧的茧壳碎片，分别放入500 mL容量瓶中，分别加入蒸馏水250 mL，放入SYQ·STX－280型手提式高压蒸汽消毒锅中在125℃高压下蒸煮2.5 h，待5种茧壳的蒸煮液完全冷却后取出分别用纱布过滤，过滤出的生丝再用30℃的温水洗涤3遍，将蚕丝脱胶液和对应的洗涤液合并，然后用滤纸抽滤，分别将5种丝胶溶液在80℃旋转蒸发至约100 mL，所得丝胶液体在冷冻干燥机的冷冻盘中自然冷却至室温后再转入－40℃条件下冷冻2 h，然后放入冷冻干燥仪，在样品温度－33℃、1 Pa条件下干燥。获得绿S纯丝胶蚕茧丝胶蛋白粉、白S纯丝胶蚕茧丝胶蛋白粉、JS普通蚕茧丝胶蛋白粉、远缘杂交普通黄色蚕茧丝胶蛋白粉及远缘杂交普通白色蚕茧丝胶蛋白粉样品，在4℃的冰箱中保存备用。

1.2.2 不同品种蚕茧茧壳丝胶蛋白质含量测定与氨基酸组成分析 按照文献［4］的凯式定氮方法进行。以1.2.1获得的绿S纯丝胶蚕茧丝胶蛋白粉、白S纯丝胶蚕茧丝胶蛋白粉及JS普通蚕茧丝胶蛋白粉，操作参照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白质的测定方法》［5］进行。测定结果根据下面的公式［5］计算出蛋白质含量，用Microsoft Excel软件制作柱式图。

［式中X为蛋白质含量(%)，V1为样品消耗硫酸标准溶液或HCL标准溶液的体积(mL)，V2为试剂空白消耗硫酸标准溶液或HCL标准溶液的体积(mL)，N为硫酸标准溶液或HCL标准溶液的摩尔质量浓度(mol/L)，0.014为 0.5 mol/L硫酸或1 mol/L HCL标准溶液1 mL相当于氮的克数，m为样品的质量(g)，F为氮换算为蛋白质的系数。］

表1 不同品种蚕茧茧壳丝胶蛋白粉的蛋白质含量

1.2.3 不同品种蚕茧茧壳丝胶蛋白质抗氧化性的测定 利用吸光值测定，计算羟基自由基、超氧自由基的清除能力，操作按照陈复生等［6］的方法进行。在风味酶浓度4 mg/mL、pH7.0、反应温度60℃、底物浓度10 mg/mL、反应时间120 min的条件下水解丝胶蛋白质，将丝胶蛋白质水解液在波长536 nm条件下检测吸光度，所得结果根据下面的公式计算出羟基自由基的去除率;再将丝胶蛋白质水解液在100℃条件下灭活10 min，将灭活后的丝胶蛋白质水解液在波长536 nm条件下检测吸光度，所得结果根据下面的公式计算出超氧自由基去除率。

羟基自由基(超氧自由基)去除率(%)=［A3－(A1－A2)］/A3×100［式中A1为对照不加样品的吸光度;A2为某浓度时的吸光度;A3为无显色剂时的该浓度的吸光度本底值。］

1.2.4 不同品种蚕茧茧壳丝胶蛋白质抗菌性能的测定 操作按照李冰等［7］的方法进行，将定性滤纸于HG101－2型电热鼓风干燥箱中在80℃下干热灭菌4 h后，分别将灭菌后的滤纸片浸入蛋白质含量为1、10、100 mg/mL浓度的3种丝胶蛋白质溶液中泡30 min后取出晾干备用。分别将大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌、酵母菌、米曲霉、黑曲霉菌菌种在超净工作台里无菌操作接种到盛有对应的培养基的培养皿(或试管)中，接种好后大肠杆菌在37℃培养6 h、枯草杆菌在37℃培养4 h、金黄色葡萄球菌在37℃培养24 h、酵母菌在25℃培养48 h、米曲霉在30℃培养72 h、黑曲霉在37℃培养5 h。用接种环将预先接种培养好的各种菌种的菌落轻刮下来置于盛有10 mL双蒸水的离心管中，将盛有各种菌种的菌落刮落液置旋涡混合器中充分混匀。用200 μL规格的移液枪分别吸取0.1 mL各种菌悬液均匀涂布在预先浇制好的对应的平板培养基上，静置5 min左右。将滤纸片按丝胶溶液浓度成正三角形放在涂布有各种菌悬液的各平板培养基表面，平板培养基中间以贴上浸有相应水溶液浸泡过的滤纸片作为空白对照，细菌在36℃左右，恒温培养24 h，真菌在28℃左右恒温培养72 h，测量抑菌圈直径。

1.2.5 不同品种蚕茧茧壳丝胶蛋白质的紫外吸收光谱分析 操作按照陈复生［8］的方法进行。分别用双蒸水将不同样本的丝胶蛋白质配制成5 mg/mL的丝胶蛋白质溶液，室温下磁力棒低速搅拌1 h，使溶液分散均匀，将不同样本的丝胶蛋白质溶液(5 mg/mL)置于190～500 nm波段的紫外分光光度计下测定吸收光谱，根据吸收光谱曲线，判断丝胶蛋白紫外吸收光谱。

2 结果与分析

2.1 不同品种蚕茧茧壳中丝胶蛋白质含量与氨基酸组成分析

由图1可见，丝胶蛋白质含量以白S纯丝胶蚕茧茧壳的最高，达到92.25%，其次是绿S纯丝胶蚕茧茧壳，达到91.27%，如加上温水洗涤蚕茧茧壳的丝胶损失部分，纯丝胶茧茧壳的丝胶蛋白质含量将更高。而现行家蚕品种JS蚕茧茧壳的丝胶蛋白质含量仅为25.03%。表明纯丝胶蚕茧蚕品种绿S和白S生产的为全天然纯丝胶蛋白质蚕茧。

图1 不同品种蚕茧茧壳的丝胶蛋白质含量

由表2知，3种蚕茧茧壳的丝胶蛋白质的氨基酸成分中丝氨酸(Ser)的含量分别为绿S 36.865 0%、白S 34.688 7%、JS 30.939 8%，绿 S达到36%以上;甘氨酸(Gly)的含量分别为绿S 15.021 0%、白S 15.665 5%、JS 14.574 0%，绿S达到15%以上;丝氨酸(Ser)和甘氨酸(Gly)的合计含量分别为绿 S 51.886 0%、白S 50.354 2%、JS 45.513 8%，绿S丝氨酸(Ser)和甘氨酸(Gly)的合计含量占到丝胶蛋白质的氨基酸组成的51%以上;丝氨酸(Ser)和甘氨酸(Gly)的含量以绿S含量最高。

表2 不同品种蚕茧茧壳的丝胶蛋白质的氨基酸组成 %

2.2 不同品种蚕茧茧壳丝胶蛋白质的抗氧化活性分析

图2 不同品种蚕茧茧壳丝胶蛋白质清除羟基自由基的效果

由图2－3可见，天然纯丝胶蚕茧的丝胶蛋白质清除羟基自由基和清除超氧自由基的能力远远强于普通蚕茧的丝胶蛋白质;不同颜色蚕茧的丝胶蛋白质清除羟基自由基和清除超氧自由基能力的顺序依次为绿S＞白S＞远缘杂交普通黄色茧＞远缘杂交普通白色茧＞JS;绿S的丝胶蛋白质抗氧化能力最强。

图3 不同品种蚕茧茧壳丝胶蛋白质清除超氧自由基的效果

2.3 不同品种蚕茧茧壳丝胶蛋白质的紫外吸收光谱

由不同品种蚕茧茧壳丝胶蛋白质的紫外吸收光谱(图4)可见，在丝胶蛋白质浓度为0.5%时，绿S、白S、JS在190～252 nm均出现2个吸收峰，都具有很强的吸收能力。但在其后白S、JS蛋白质的紫外吸收趋势迅速降低，而绿S蛋白质的紫外吸收趋势减缓，尤其在315～500 nm的波域内，绿S蛋白质的紫外吸收仍然具有较强的能力。

图4 不同品种蚕茧茧壳丝胶蛋白质的紫外吸收光谱

2.4 不同品种蚕茧茧壳丝胶蛋白质的抗菌能力

由表3和图5可看出，不同品种蚕茧茧壳丝胶蛋白质对大肠杆菌、曲霉菌、酵母菌均具有较强的抗菌能力，抗菌能力由强到弱的顺序为绿S＞白S＞JS。

表3 不同品种蚕茧茧壳丝胶蛋白质对供试菌的抑菌效果

图5 不同品种蚕茧茧壳丝胶蛋白质的抗菌能力

3 小结与讨论

天然丝胶蛋白质作为化妆、保健、医药创新产品的优质原料，已引起人们的广泛关注，其利用价值在于其具有诸多独特的、有用的功能特性［1］。

有色茧丝蛋白质的生成是蚕食下的桑叶中含有的胡萝卜色素和类黄酮色素在蚕体内由一系列的遗传基因控制，透过并运输到肠腔细胞、体液、丝腺细胞，在丝腺中合成和分泌有色丝胶蛋白质，形成有色蚕茧［2］。有色茧丝的色泽多集中于蚕茧外层的丝胶上。

本试验以品种组合生产的天然纯丝胶蚕茧溶解提取的丝胶蛋白质与普通蚕茧溶解提取的丝胶蛋白质为材料，对其部分主要功能特性进行了试验比较，纯丝胶蚕茧丝胶溶解提取的丝胶蛋白质显示出在含量、抗氧化、防紫外线、抗菌等方面具有优良功能特性，而绿色纯丝胶蚕茧的丝胶蛋白质的这些功能特性更为优秀。试验结果表明，绿色纯丝胶品种组合生产的天然、纯粹、无变性蚕茧可直接溶解提取的丝胶蛋白质，更具广泛的利用价值，作为原料在化妆品、保健品、医药等领域的产品创新具有广泛的应用前景。本试验中凯式定氮方法调查的不同蚕茧的丝胶蛋白质含量，纯丝胶蚕茧茧壳远远高于普通蚕茧茧壳，绿色纯丝胶蚕茧茧壳稍低于白色纯丝胶蚕茧茧壳;丝胶蛋白质的氨基酸成分中丝氨酸(Ser)和甘氨酸(Gly)的含量以绿S含量最高。推测蚕茧的丝胶蛋白质含量及丝胶蛋白质氨基酸组成对其功能特性有一定的影响，原因有待进一步的深入研究。

本试验只对部分有色蚕茧丝胶蛋白质的功能特性作了探讨，其他相当多的功能特性如化妆品的乳化性、湿润性、吸放湿性、粘合和分散性等，保健食品的浑浊度、色泽、风味、爽滑感等，与医药归纳为物质的结合等功能特性有待于进一步的深入研究。

［1］董雪，盛家镛，邢铁玲，等.丝胶蛋白的研究与应用综述［J］.丝绸，2011，48(12):16－21.

［2］作道隆，土田耕三.繭の色はどのようにして彩られるか［J］.日本生化学，2009，81(1):27－31.

［3］飯田のり子，鶴井裕治，田中幸夫，等.実用的な緑繭蚕品種の育成［J］.蚕糸会研報，2008(55):57－63.

［4］叶崇军，盛玉奇，魏兆军，等.全天然丝胶蚕品种的丝胶蛋白质含量与氨基酸组成［J］.食品科技，2010，35(8):146－149.

［5］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.食品安全国家标准食品中蛋白质的测定:GB/T 5009.5—2010［S］.北京:中华人民共和国卫生部，2010:1－7.

［6］陈复生.全丝胶蚕品种丝胶蛋白酶的抗氧化能力［J］.中国化妆品，2010(2):36－41.

［7］李冰，叶崇军，陈复生.全天然丝胶抗菌性研究［C］//中国蚕学会，云南省蚕学会，云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所.中国蚕学会第八届青年学术研讨会论文集，昆明:［出版者不详］，2014:283－285.

［8］陈复生，叶崇军，魏兆军.蚕丝天然丝胶蛋白的紫外吸收能力研究［J］.天然产物研究与开发，2013，25(3):388－390.

S881.3

A

1007－0982(2016)04－0050－05

10.16839/j.cnki.zgcy.2016.04.012

2016－06－29;接受日期:2016－09－30

安徽省自然科学基金项目(编号1608085MC75);现代农业产业技术体系建设专项(编号 CARS－22);安徽省农业科学院种子工程项目(编号15B0605)。

第1作者信息:叶崇军(1983—)，男，安徽六安，硕士，助理研究员。Tel:0551－2852900，E-mail:yechj1983@163.com

信息:陈复生(1958—)，男，安徽全椒，博士，研究员。Tel:0551－2852900，E-mail:chenfs58@163.com