梨花迁粉蝶微孢子虫对家蚕的感染性及胚种传染性研究

陈世良 高建华 陈海佺 黎永谋 邓 欢 高 翔 朱 峰

(云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101)

梨花迁粉蝶微孢子虫对家蚕的感染性及胚种传染性研究

陈世良 高建华 陈海佺 黎永谋 邓 欢 高 翔 朱 峰

(云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101)

通过人工添食的方法，用不同保存条件下的梨花迁粉蝶微孢子虫感染家蚕4龄起蚕，以确定梨花迁粉蝶微孢子虫对家蚕的感染性、胚种传染性以及食下感染率、胚种传染率的差异。试验结果表明，梨花迁粉蝶微孢子虫对家蚕具有很强的感染性和胚种传染性。以梨花迁粉蝶体中新鲜微孢子虫的食下感染率最高，为89.2%;以蛾体形式保存在4℃冰箱中半年的微孢子虫食下感染率次之，为84.8%;以蛾体形式保存在自然环境中半年的微孢子虫食下感染率较低，为13.3%;以微孢子虫水溶液形态保存于4℃冰箱中半年的食下感染率最低，为3.4%。家蚕转青卵检验胚种传染率，以梨花迁粉蝶体中新鲜微孢子虫的最高，为25.3%;4℃冰箱中存放半年的梨花迁粉蝶体中微孢子虫的次之，为19.3%;自然环境中存放半年梨花迁粉蝶体中微孢子虫的较低，为18.7%;以微孢子虫水溶液形态保存于4℃冰箱中半年梨花迁粉蝶微孢子虫的最低，为11.3%。

家蚕;梨花迁粉蝶;微孢子虫;保存形式;感染性;胚种传染性

目前关于其对家蚕感染性的研究几乎是空白。为了弄清楚该微孢子虫在新鲜状态和以不同条件保存半年后对家蚕的感染性及胚种传染性，为家蚕微粒子病的病原检测和病害防治提供依据，我们在2007年预备试验的基础上，2015年以来通过人工添食的方法，利用不同保存条件下的梨花迁粉蝶微孢子虫对家蚕的感染性进行试验，以确定梨花迁粉蝶微孢子虫对家蚕的感染性、胚种传染性以及食下感染率、胚种传染率的差异。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 梨花迁粉蝶微孢子虫病原体 通过捕捉云南省蒙自市田间地头飞翔的梨花迁粉蝶，经镜检确定后得到并保存。

1.1.2 供试家蚕品种 932·芙蓉，云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所保存提供，正常催青饲养至4龄起蚕供试。

1.1.3 主要仪器设备 尼康YS100生物显微镜，上海中恒仪器有限公司产品;KDC－170型离心机，科大创新股份有限公司产品;血球计数板，上海市求精生化试剂有限公司产品;移液枪，上海生物工程有限公司产品;乳钵、乳棒、滴管、排笔均为市售产品。

1.2 试验方法

1.2.1 梨花迁粉蝶微孢子虫病原体的收集鉴定与处理 于2015年早秋，在云南省蒙自地区田间地头通过人工捕捉的方式共捕捉到了飞翔的梨花迁粉蝶60只，分别将捕捉到的每只梨花迁粉蝶剪下翅膀进行研磨，将研磨液用尼康YS100生物显微镜进行镜检，得到确定有微孢子虫的梨花迁粉蝶31只，对确定有梨花迁粉蝶微孢子虫的31只梨花迁粉蝶分别作如下处理:(1)7只梨花迁粉蝶以蛾体形态在自然环境中保存半年;(2)7只梨花迁粉蝶以蛾体形态在4℃冰箱中保存半年;(3)17只梨花迁粉蝶经过研磨、过滤、离心、纯化，收集新鲜裸孢子，将收集到的新鲜裸孢子液分成2份，一份马上用于对4龄家蚕进行新鲜裸孢子添食、一份以水溶液形态于4℃冰箱中保存半年，到2016年春用于对4龄家蚕进行裸孢子添食试验。(4)从收集到的新鲜裸孢子液中取少部分微孢子虫样品委托重庆师范大学生命科学学院进行分子生物学鉴定。添食试验分2次进行，第1次是(2015年8月)利用从刚捕捉到的梨花迁粉蝶体内收集到的新鲜裸微孢子虫液对4龄家蚕起蚕进行添食，第2次是(2016年3月)以不同状态存放半年后的梨花迁粉蝶微孢子虫对4龄家蚕起蚕进行添食。

1.2.2 病原体制备 (1)于2015年8月将1.2.1项(3)得到的新鲜的梨花迁粉蝶裸微孢子虫液，配制成浓度为 1.98×107个/mL的孢子液。(2)于2016年3月用以蛾体形态在自然环境中存放和以蛾体形态在4℃冰箱中存放半年的2种梨花迁粉蝶体内的微孢子虫及以微孢子虫水溶液形态在4℃冰箱中存放半年的裸微孢子虫，前2种保存形式的微孢子虫在添食前先对蛾体进行研磨、过滤、离心、纯化制成微孢子虫液。添食时统一将纯化的梨化迁粉蝶微孢子虫配制成浓度为1.98×107个/mL的微孢子虫液;同时给4龄起蚕进行添食。

1.2.3 家蚕分区和梨花迁粉蝶微孢子虫的添食(1)于2015年8月10日用新鲜梨花迁粉蝶微孢子虫对200头4龄起蚕进行添食，同时以不添食病原物为空白对照。用移液枪吸取制得的新鲜的梨花迁粉蝶裸微孢子虫液(孢子浓度为1.98×107个/mL) 1 mL，均匀地涂抹在1片大小为240～250 cm2的桑叶的正反两面上，共涂抹桑叶4片，晾干后饲喂4龄起蚕，待蚕基本吃完带毒叶后换普通桑叶常规饲养，每日给桑3次，并全程饲喂经过清洗的桑叶。饲育至蚕结茧化蛾，对蚕蛾逐头镜检，调查蚕蛾发病情况。(2)于2016年3月15日将4龄起蚕分成4区，每区数蚕200头，分别添食以上3种保存形式(以蛾体形态在自然环境中存放半年和以蛾体形态在4℃冰箱中存放半年的2种梨花迁粉蝶体内的微孢子虫及以孢子水溶液形态在4℃冰箱中存放半年的裸微孢子虫)的微孢子虫，以不添食病原物为空白对照。用移液枪分别吸取不同保存形式制得的梨花迁粉蝶微孢子虫液(孢子浓度为1.98×107个/mL)1 mL，均匀地涂抹在1片大小为240～250 cm2的桑叶的正反两面上，每个处理区涂抹桑叶4片，晾干后每个处理区分别给予对应的带毒叶4片饲喂4龄起蚕，待蚕基本吃完带毒叶后换普通桑叶常规饲养，每日给桑3次，并全程饲喂经过清洗的桑叶。饲育至蚕结茧化蛾，对蚕蛾逐头镜检，调查蚕蛾发病情况。

或许因为是冬天，让人感觉到静逸和冷凉。这是一所怎样的学校，期待的落差渐渐强烈，心里嘀咕广艺外学院怎么选择这样的一所学校，值得我们名师来参观吗？

1.2.4 感染梨花迁粉蝶微孢子虫的家蚕母蛾所产蚕卵的患病情况 将羽化后的家蚕母蛾，分别与健康的雄蛾(空白对照未添食微孢子虫的蚕羽化的雄蛾)交配后以单蛾形式生产部分蚕种，进行即时浸酸处理。添食梨花迁粉蝶微孢子虫后感染梨花迁粉蝶微孢子虫的家蚕母蛾所产蚕卵，经过母蛾检验，留下感病母蛾所产的卵圈，将感病母蛾所产的卵圈催青后分别对转青卵、蚁蚕、卵壳进行显微镜检验。转青卵以粒为单位逐粒检验，蚁蚕、卵壳以卵圈为单位进行集团检验，检查转青卵、蚁蚕、卵壳的带毒情况。

2 结果与分析

2.1 供试梨花迁粉蝶微孢子虫的病原鉴定结果

委托重庆师范大学生命科学学院对供试的梨花迁粉蝶微孢子虫进行分子生物学鉴定，通过将供试的梨花迁粉蝶微孢子虫与我们之前分离获得的梨花迁粉蝶微孢子虫Nosema sp.CP的克隆序列进行两两比较，结果显示它们在核糖体16s rDNA序列之间高度相似，相似度在99.0%以上，确定了该微孢子虫与郑丽金等［11］报道的梨花迁粉蝶微孢子虫为同一物种(图1－2)。

图1 梨花迁粉蝶

图2 梨花迁粉蝶微孢子虫［640(16×40)倍］

2.2 家蚕幼虫食下梨花迁粉蝶微孢子虫后羽化的蚕蛾梨花迁粉蝶微孢子虫感染情况

从表1可以看出:添食新鲜梨花迁粉蝶微孢子虫、不同保存环境和保存状态下的梨花迁粉蝶微孢子虫感染家蚕有很大的差异，以添食新鲜梨花迁粉蝶微孢子虫的感染率最高，达到89.2%;添食以蛾体形态在4℃冰箱中存放半年的梨花迁粉蝶微孢子虫感染率稍低，为84.8%;添食以蛾体形态在自然环境中存放半年的梨花迁粉蝶微孢子虫感染率较低，为13.3%;添食以微孢子虫水溶液形态在4℃冰箱中存放半年的梨花迁粉蝶裸微孢子虫感染率最低，只有3.4%;空白对照区感染率为0。

表1 不同保存形式梨花迁粉蝶微孢子虫添食4龄家蚕后羽化的蚕蛾检验结果

2.3 感染梨花迁粉蝶微孢子虫的家蚕母蛾所产蚕卵患病情况

从表2可以看出，通过随机抽取各种保存形式的梨花迁粉蝶微孢子虫感染后患病母蛾所产下的蚕卵(转青卵)3个卵圈各100粒进行单粒卵镜检，结果梨花迁粉蝶体中新鲜微孢子虫、以蛾体形态在自然环境中存放半年的梨花迁粉蝶微孢子虫、以蛾体形态在4℃冰箱中存放半年的梨花迁粉蝶微孢子虫、以微孢子虫水溶液形态在4℃冰箱中存放半年的梨花迁粉蝶裸微孢子虫4种保存形式添食家蚕的母蛾所产的蚕卵都有带病卵，病卵率在11.3%～25.3%之间，平均为18.7%，其中添食新鲜梨花迁粉蝶微孢子虫家蚕母蛾所产蚕卵的病卵率最高为25.3%，添食以微孢子虫水溶液形态在4℃冰箱中存放半年的梨花迁粉蝶裸微孢子虫家蚕母蛾所产蚕卵的病卵率最低为11.3%，添食以蛾体形态在自然环境中存放半年的梨花迁粉蝶微孢子虫家蚕母蛾所产蚕卵的病卵率和添食以蛾体形态在4℃冰箱中存放半年的梨花迁粉蝶微孢子虫家蚕母蛾所产蚕卵的病卵率相差不大，分别为18.7%和19.3%。对其病蛾所产的卵经催青孵化后的蚁蚕、卵壳分别以卵圈为单位进行检验，结果整个卵圈蚁蚕集团检验检出率在89.3%～100%之间，平均为95.3%;卵壳集团检验检出率在88.9%～96.4%之间，平均为93.0%，表明同一卵圈，无论是蚁蚕或是卵壳，都有检验到微孢子虫孢子的可能。

表2 不同保存形式梨花迁粉蝶微孢子虫感染家蚕母蛾所产蚕卵的转青卵、蚁蚕、卵壳的检验结果

3 小结与讨论

从梨花迁粉蝶新鲜微孢子虫和3种不同保存形式存放了半年的梨花迁粉蝶微孢子虫对家蚕的感染性添食试验结果可知，新鲜的梨花迁粉蝶微孢子虫和以蛾体的形态在4℃冰箱中保存半年的梨花迁粉蝶微孢子虫对家蚕均有很高的感染率，这2种保存形式有利于保持梨花迁粉蝶微孢子虫的活性。

梨花迁粉蝶微孢子虫对家蚕具有感染性和胚种传染性，但是添食不同存放环境和存放形式的梨花迁粉蝶微孢子虫对家蚕的感染有差异，以添食新鲜梨花迁粉蝶微孢子虫的感染率最高，添食以蛾体形态在4℃冰箱中保存半年的梨花迁粉蝶微孢子虫的感染率次之，添食以蛾体形式保存在自然环境中半年的梨花迁粉蝶微孢子虫感染率较低，添食以微孢子虫水溶液形态在4℃冰箱中保存半年的梨花迁粉蝶裸微孢子虫感染率最低。与新鲜梨花迁粉蝶微孢子虫对家蚕的感染率为89.2%相比，以蛾体形式在4℃冰箱中保存半年的梨花迁粉蝶微孢子虫对家蚕的感染率、以蛾体形式保存在自然环境中半年的梨花迁粉蝶微孢子虫对家蚕的感染率、以水溶液形态在4℃冰箱中保存半年的梨花迁粉蝶裸微孢子虫对家蚕的感染率分别下降了4.4、75.9、85.8个百分点。同时还可以看出，只要家蚕母蛾感病，其所产的蚕卵不论是在转青卵、蚁蚕、卵壳中都可以检验到一定数量的微孢子虫，虽然4种保存形式的梨花迁粉蝶微孢子虫试验调查结果在一定的范围内有开差，但足以证明梨花迁粉蝶微孢子虫对家蚕具有一定的胚种传染性。从不同存放形式的梨花迁粉蝶微孢子虫感染家蚕母蛾所产蚕卵(转青卵)的微孢子虫的检验结果看，平均有18.7%的蚕卵胚胎中检查到微孢子虫。由试验结果可知，梨花迁粉蝶微孢子虫对家蚕的胚种传染率比家蚕微孢子虫低，但又比菜粉蝶微孢子虫对家蚕的胚种传染率(4.55%～5.07%)高［12－13］。

微粒子病对蚕业生产的危害是非常大的，家蚕除食下感染外，胚种传染也是一个重要的原因，故在各级蚕种繁育过程中，防治微粒子病除加强对母蛾检疫外，对蚕种实施“补正检查”［1，14］也是很有必要的，它确保了从源头上对微粒子病的预防和控制，杜绝胚种传染对蚕业生产的危害。此外，加强桑园病虫害和野外昆虫的防治，杀灭微孢子虫的寄主和中间宿主，切断野外昆虫微孢子虫交叉感染家蚕［15－16］，是综合防治家蚕微粒子病的重要措施。

［1］沈中元，万永继，鲁兴萌，等.家蚕微粒子病综合防治技术［M］.北京:中国农业出版社，2015:4－19.

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S884.2+1

A

1007－0982(2016)04－0032－05

10.16839/j.cnki.zgcy.2016.04.008

2016－05－13;接受日期:2016－09－07

云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所青年创新基金项目(编号QC2015001)。

第1作者信息:陈世良(1964—)，男，云南陆良，本科，副研究员。Tel:13608734908，E-mail:chenshl123@163.com

信息:朱峰(1984—)，男，山东枣庄，博士，副研究员。Tel:18287322700，E-mail:zf200537@163.com