自噬相关机制在颅脑创伤中的研究进展

刘 源 王 蓉

(首都医科大学宣武医院中心实验室 北京市老年病医疗研究中心 神经变性病教育部重点实验室 北京脑重大疾病研究院，北京 100053)



· 神经系统疾病的基础研究 ·

自噬相关机制在颅脑创伤中的研究进展

刘 源 王 蓉*

(首都医科大学宣武医院中心实验室 北京市老年病医疗研究中心 神经变性病教育部重点实验室 北京脑重大疾病研究院，北京 100053)

颅脑创伤(traumatic brain injury,TBI)是世界范围内年轻人和成年人致残的最重要的原因之一。病死率高，而幸存者常伴有身体的残疾、精神障碍等后遗症，为社会发展带来了沉重的负担。自噬是近年来研究的一个热点领域，近年来关于TBI继发性损害机制中自噬的研究逐渐增多，但仍有许多机制有待阐明，本文将从TBI后自噬的变化以及其相关机制进行阐述。

颅脑创伤；自噬；自噬相关机制

颅脑创伤(traumatic brain injury，TBI)是指因开放或闭合性脑损伤引起的脑功能损害。世界范围内每年因高空坠落、车祸、运动或战争及其他原因导致TBI而就医的就有数百万人[1]。TBI病死率非常高，而幸存者常伴有记忆力和注意力的下降，以及信息处理障碍等问题。TBI中一些细胞死亡由原发性损伤引起，如直接机械性损伤；但是更多的细胞死亡是由之后的继发性损伤引起的，这些继发性损伤机制主要包括：氧化应激、炎性反应、神经递质功能障碍、线粒体功能障碍、凋亡、自噬等[2-6]。自噬是近年来研究的一个热点领域，是细胞降解损伤及丧失功能的细胞器或蛋白, 维持细胞更新和稳态的关键细胞机制。自噬可通过不同的途径, 将细胞中的物质运送到溶酶体进行降解,包括：大自噬(macroautophagy)、小自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬。通常所说的自噬即指大自噬。近年来关于TBI继发性损伤机制中自噬的研究[7-10]虽有增多，但仍有许多机制尚未明确，本文将从TBI后自噬的变化以及其相关机制进行阐述。

1 TBI后自噬相关蛋白及自噬流的变化

关于脑外伤治疗的研究主要集中于通过调节细胞死亡程序中的相应靶点来保护神经元。除直接机械性损伤引起的细胞死亡外，凋亡与自噬性细胞死亡也占有相当比例，而自噬对于受损细胞既存在保护作用也可加剧细胞损伤，主要取决于自噬在损伤后所处的作用倾向及阶段。自噬参与了创伤性脑损伤后细胞生存和死亡机制的调节。因此，研究TBI后自噬在神经损伤和修复中所起的作用意义重大[11]。已有文献[12-13]报道了的TBI后自噬相关生物化学过程的改变。然而，直到现在其具体的机制及其所起的作用也未被完全阐明。一些文献[13-15]从不同角度证实创伤性脑损伤后会出现不同程度的自噬增加现象，但具体机制和功能仍存在争议。

目前已经开始明确的是因外伤引起的自噬水平及自噬流的改变，以及干预的措施及潜在的治疗靶点。TBI后4 h用电镜观察到大鼠损伤部位的大脑新皮质(皮质3～5层)周围自噬体及自噬溶酶体是增加的，并在伤后的5～15 d用荧光共聚焦显微镜观察到了LC3-Ⅱ阳性细胞数量的增加以及自噬相关基因(autophagy-related gene，ATG) 12-ATG5结合物增加[12]。同样，有研究[13]显示人类TBI后3.5 h开始LC3也出现了升高。许多研究[14-16]指出，在TBI后数周至数月自噬标志物仍保持较高水平。这种长期的自噬增加不仅存在于自噬急性期，而且存在于慢性期中，并伴随神经退行性变和/或神经恢复的过程。需进一步在TBI造模后通过长期的观察来阐明这种持续的改变。

现在尚未明确的是TBI后自噬体的增加是因为自噬体生成增加，还是因为自噬流增加或自噬体降解障碍而引起的自噬流障碍，抑或两者都有。许多早期的研究[12]都通过电镜或自噬体标志蛋白LC3-Ⅱ水平的增加而得出TBI后自噬体聚积；然而，他们并未提及自噬流。最近，自噬流已在许多TBI动物模型上通过对自噬底物(SQSTM1/P62)水平的检测加以说明。

P62是一种指引泛素化蛋白进入自噬体进行降解的连接蛋白。P62可伴随自噬流一并被水解，出现水平降低；相反，当自噬流障碍时，P62水平升高。P62也可被在翻译水平调节，因此，进一步的研究很有必要弄清其在转录、翻译水平的调节过程。有研究指出TBI动物模型中P62与LC3-Ⅱ水平均升高[14]。

Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-羟激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K)的调节亚基(BECN1/Beclin1)水平增高是自噬体形成的必备条件。在急性局部小脑损伤的小鼠模型中，通过LC3-Ⅱ的一系列检测表明了自噬流增加[15]。而在体外实验中，通常是用加和不加自噬抑制剂进行细胞培养(如SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系)后对比LC3-Ⅱ蛋白水平来研究自噬水平的改变。加自噬抑制剂，如氯喹(chloroquine，CQ，一种溶酶体复合物，可中和溶酶体pH值),Bafilomycin A(V-ATPase 抑制剂)或E-64d/抑胃酶肽A(溶酶体水解酶抑制剂),可使LC3-Ⅱ水平明显升高[16]。当自噬流被阻断时，CQ则不能进一步升高LC3水平。用此方法在GFP-LC3转基因自噬受体鼠中用脑室注射CQ的方式进行研究[15]表明内生的LC3-Ⅱ和神经元的GFP-LC3阳性荧光斑点数量与自噬体数量增加呈正相关，在小脑损伤后这些LC3阳性荧光斑点可进一步增多，用CQ干预后仍可进一步增多。这说明了小脑损伤后自噬流是增加的。

相反，近期关于GFP-LC3小鼠脑震荡模型的研究指出TBI后小鼠自噬流是抑制的。用Western blotting法和免疫组织化学法均证明了损伤部位周围自噬体增加伴随P62水平的升高。通过体内试验对损伤组和对照组的脑切片在CQ环境下和无CQ环境下的LC3-Ⅱ水平进行检测，发现CQ增加了对照组中LC3-Ⅱ的水平，但在损伤组中并未增加。在这个模型中，出现了短暂的自噬流抑制(P62水平在TBI后1周恢复)[17]。

出现这种自噬不同的原因并不清楚，这可能是因为损伤模型不同或损伤严重程度不同而影响自噬激活或自噬流的程度不同所致。如对于轻度TBI自噬流的激活是一种保护机制。有研究[15]显示，与正常野生型对照组相比，自噬基因Becn1缺陷鼠的细胞死亡多且功能预后差。另外，许多严重的损伤可改变邻近部位区域自噬体的转运和降解，引起自噬流障碍。最近一项对人类尸体脑标本的研究[13]显示，P62在绝大多数标本中都升高，在TBI后生存时间最短的标本中均发现了P62的水平显著升高，这表明了TBI损伤严重程度与P62水平升高程度有关。

2 TBI后参与自噬的相关信号通路改变

在TBI后自噬相关调节机制的研究需要通过应用自噬抑制剂或自噬诱导剂来观察。然而，绝大多数情况下没有确切证据证实自噬有确切的信号转导通路，也没有准确的体外模型系统来模拟TBI后的脑损伤[18]。

TBI后最常见的关于自噬的机制是BECN1蛋白的增高及BECN1/BCL2复合体的降低，这样可增加Ⅲ型PI3K的激活以及自噬体的生成。但TBI后BECN1为什么会增高目前仍不清楚。潜在的机制可能是：BECN1蛋白位于细胞膜上，与N-甲基-D天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor，NR2B)形成复合体。TBI可引起BECN1/NR2B复合体解离，释放BECN1，这可能诱导了自噬。另一个潜在的机制是缝隙连接蛋白43(gap junction protein connexin 43，CX43/GJA1)可直接与BECN1复合体相互作用来调节自噬体的生成[19]。CX43的水平和活性可能影响着TBI后自噬的调节[20]。其他通路还有雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)，糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)，氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase，JNK)[21-22]，然而，他们参与TBI后调节的机制仍需要进一步研究。

3 TBI后自噬与溶酶体

在TBI后自噬流障碍时，大量组织蛋白酶D(cathepsin D，CTSD)阳性的溶酶体内出现CTSD水平和活性的降低，这说明，TBI可引起溶酶体损伤及功能障碍，这也可能是引起自噬流障碍的原因[17]。研究[23]显示，与总自噬体数量相比，LC3+/CTSD+自噬体比例下降，说明自噬流障碍，进一步研究需阐明这种自噬体的聚积是因自噬溶酶体的融合过程障碍还是因溶酶体功能整体功能降低有关，抑或两者都有。

在TBI后溶酶体可能出现损伤的机制仍不清楚。最简单的解释就是TBI的机械损伤引起溶酶体膜的完整性破坏。然而，在TBI中并没有发现可溶性的溶酶体酶渗漏至胞液中[17]。但这并不能排除溶酶体膜受到轻微破坏的可能性。这种局限的溶酶体膜透化(lysosomal membrane permeabilization，LMP)与神经元损伤相关的情况可出现在缺血性脑卒中和神经退行性疾病中[23-24]。潜在的调节因子包括：通过促凋亡的Bcl-2家族蛋白构成通道，分子伴侣热休克蛋白(heat shock protein 70，HSP70)的抑制和钙蛋白酶介导的裂解，最终导致溶酶体膜不稳定[25]。BAX和HSP70均参与了TBI后继发性损伤的过程。溶酶体障碍可引起细胞毒性，但仍需要进一步的研究来阐明TBI后溶酶体损伤的具体机制。

4 TBI后自噬与氧化应激

TBI后另一个与自噬流改变相关的因素是活性氧(reactive oxygen species，ROS)。之前的研究[26-27]显示ROS在不同的水平和环境下即可促进自噬又可抑制自噬。促进自噬是通过直接通过调节自噬相关蛋白ATG4，或直接调节上游腺苷酸活化蛋白激酶[adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK]通路来直接促进自噬[28]。而大量的ROS和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)可抑制自噬，如它们可通过亚硝基化JNK的成分及mTOR通路[29]。HSP70在氧化条件下也可被羰基化，可使其更易被钙蛋白酶裂解。这种导致LMP的机制已在脑缺血中观察到[30]，在TBI中可能起相同的作用，或者溶酶体膜直接被氧化损伤。因此，ROS和RNS是激活还是抑制自噬流与其水平和损伤的具体机制及程度相关。

5 TBI后自噬与炎性反应

TBI引起一系列的炎性反应可不同程度的激活星形胶质细胞和小胶质细胞，它们激活后会释放多种细胞因子或炎性因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6等，扩大神经炎性反应，一系列的炎性反应因子和细胞因子会扩散至正常脑组织，使正常脑组织也受相应的损伤。TBI后自噬与炎性反应之间的关系还存在着争议，如有研究在小鼠TBI造模后4 h通过给予腹腔注射自噬激活剂雷帕霉素后改善了小鼠的神经功能，减少了小胶质细胞的激活，用药组的Beclin1水平较对照组轻度升高，说明了自噬增强可能减轻炎性反应[31]。而也有研究[9]得到了相反的结果。而出现这种相反结果的可能是目前仍没有单一作用的自噬激活剂，也可能是所用动物不同或造模方法不同而导致。仍需进一步的研究来说明。

6 展望

目前关于继发性脑损伤机制研究的热点主要集中在自噬炎性反应等方面，在TBI后继发性脑损伤的机制中关于自噬的研究相对较多，得出的结论仍存在许多争议[31-34]。关于TBI后自噬的许多重要机制仍未阐明，如TBI后自噬相关蛋白的增高是因为自噬流障碍还是因为自噬增加所致。如果是自噬障碍，是因为溶酶体原因还是因为自噬体与溶酶体融合过程出现了问题?TBI后自噬相关通路是如何变化的?具体哪些通路能怎样影响自噬?这些通路之间是否存在交互作用以及引起这些变化的原因仍需进一步的研究来阐明。本领域的相关研究大有可为。

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编辑 慕 萌

Research progress in the autophagy related mechanisms in traumatic brain injury

Liu Yuan, Wang Rong*

(CentralLaboratory,XuanwuHospital,CapitalMedicalUniversity,BeijingGeriatricMedicalResearchCenter,KeyLaboratoryforNeurodegenerativeDisease，MinistryofEducation,BeijingInstituteforBrainDisorders,Beijing100053,China)

Traumatic brain injury (TBI) is one of the most important causes of disability of the young people and adults around the world, which caused high mortality and the survivors often accompanied sequelae of physical disability, mental disability and so on. TBI brings a heavy burden to the society development. Autophagy is a hot research field in recent years. Although the study on the mechanism of autophagy changes in the secondary damage induced by TBI has been gradually increasing in recent years, there are still many mechanisms of autophagy to be elucidated. The main aim of this review is to elaborate on the changes of autophagy related mechanism after TBI.

traumatic brain injury；autophagy； autophagy related mechanisms

北京市自然科学基金(7132044)。This study was supported by Natural Science Foundation of Beijing(7132044).

时间：2016-12-14 20∶10

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20161214.2010.002.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.06.015]

R 651.1

2016-10-14)

*Corresponding author， E-mail：rong_wang72@aliyun.com