Wnt信号通路抑制剂Dkk-1与颞叶癫痫的关系研究进展

孙建波，朱雨岚

·综述·

Wnt信号通路抑制剂Dkk-1与颞叶癫痫的关系研究进展

孙建波，朱雨岚

Wnt信号通路在调节胚胎期神经发育、神经发生、神经元分化、稳态维持中有比较重要的作用。脊椎动物中发现的分泌蛋白Dickkof-1（Dkk-1）作为经典Wnt/β-catenin的抑制剂，与多种疾病的病理生理相关，如阿尔茨海默病、颞叶癫痫（TLE）、缺血性脑损伤、癌症、骨病等。近年来发现，在海人酸（KA）诱导癫痫模型中、TLE患者的海马组织中以及与癫痫等疾病相关的神经兴奋性毒性模型中，均有Dkk-1表达水平的改变，证明Dkk-1参与癫痫后的神经元变性的病理生理过程。本文就Wnt信号抑制剂Dkk-1与TLE的关系研究进展进行综述。

颞叶癫痫；经典wnt信号通路；Dickkopf-1

Wnt信号通路是在生物体中广泛存在的，具有高度保守性的信号通路。近年来研究表明，Wnt信号通路在胚胎发育、细胞凋亡和神经系统发育等方面具有重要作用[1]，还与许多中枢神经系统障碍性疾病相关[2]。颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy，TLE）动物模型和TLE患者的研究发现，Wnt信号通路中的经典Wnt/β-catenin通路在TLE神经发生、海马硬化等病理过程中起关键作用[3]。参与TLE中的神经元丢失、胶质增生、苔藓纤维发芽等一些主要病理特征，有助于异常海马神经回路产生，形成反复自发的癫痫病灶。研究证实，经典Wnt/β-catenin抑制剂Dkk-1参与了神经元兴奋性死亡、TLE后神经元丢失等。本文就经典Wnt/β-catenin抑制剂Dkk-1与TLE的关系进行综述。

1 经典Wnt通路及其抑制因子Dkk-1

1.1 经典Wnt信号通路

Wnt信号通路广泛参与胚胎发育中的神经形成、细胞稳态维持、细胞迁移以及成年生物体中的细胞增殖、细胞凋亡、神经系统调节等过程，具有高度保守性[4-7]。Wnts是一组已在哺乳动物中发现的包括19个家族成员的分泌糖蛋白[8]，可结合到细胞膜上G-蛋白偶联受体卷曲蛋白（Frizzleds，Fz）上，构成不同的Wnt信号通路，包括经典Wnt/β-catenin通路、平面细胞极性通路和Wnt/Ca2+通路[9,10]。其中经典Wnt/β-catenin通路的激活是通过Wnts与Frizzled受体和低密度脂蛋白受体关联蛋白（low density lipoprotein-related protein 5/6，LRP5/6）相结合，使散乱蛋白（disheveled，Dvl）高度磷酸化，从而导致包括轴蛋白（Axin）、结肠腺瘤样息肉病基因产物（APC）、糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）、β-catenin的多蛋白复合物解体。未磷酸化的β-catenin在细胞质内大量聚集，并转移到细胞核[11]，通过与T细胞因子/淋巴样增强因子结合（T-cell factor/lymphoid enhancing factor，TCF/LEF），增强下游靶基因的表达[12]。

近年来研究证实，经典Wnt/β-catenin通路在成年中枢神经系统神经分化、突触发育和可塑性及成年海马神经发生中也具有重要作用[13]。一些参与神经元存活和稳态的基因，如细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、c-myc等，都是通过激活经典Wnt/β-catenin通路而转录的[14]。研究发现，在一些致痫动物模型中，β-catenin在癫痫后神经元丢失的海马区域表达增加，并检测到Wnt/β-catenin信号通路的一些组成分子的基因发生变化，如β-catenin基因和Fz配体Wnt2、Wnt5a、Wnt10a基因等[15,16]。这表明Wnt/βcatenin信号通路在癫痫后神经元丢失、神经元新生、苔藓纤维出芽中具有重要作用。

1.2 Dkk-1

Wnt/β-catenin通路可被各种蛋白所调节，包括通过影响信号传导的细胞内调节和通过与Wnt信号分子的配体及其膜共同受体相互作用的细胞外调节[17]。Dkk-1分泌蛋白属于Dkk家族，为Wnt/βcatenin通路的细胞外调节抑制因子，在脊椎动物中，Dkk家族包括四个不同的糖蛋白，即Dkk-1、Dkk-2、Dkk-3和Dkk-4。其中Dkk-1是较早被发现具有Wnt/β-catenin通路抑制作用的，并在过去的几年中被广泛研究。Dkk-1可竞争性结合LRP5/6受体（Wnt/Dkk-1共受体），增加细胞内噬作用和LRP5/6的降解，阻止LRP5/6与Wnt信号分子和Fz形成信号复合物，从而起到拮抗Wnt/β-catenin通路的作用[18]。Dkk-1抑制Wnt/β-catenin通路调节的过程在脊椎动物胚胎发育中的肢体发育、体节形成、眼的形成和神经发育中有重要作用，并与成人骨形成与骨疾病、癌症、阿尔茨海默氏病、癫痫等有密切关系。

2 Dkk-1在神经系统中的作用

2.1 Dkk-1与胚胎期神经系统发育的关系

Dkk-1在胚胎发育过程中发挥极其重要的作用，控制脊椎动物细胞命运是其高度区域化表达的主要功能之一[19]。Dkk-1特定地表达在中内胚层的前端（准脊索前板），抑制Wnt/βcatenin通路，在神经外胚层创建Wnt信号强度梯度，引导相应的基因表达，协调包括头部在内的轴结构区域的特定诱导[20]。研究表明，Dkk-1基因敲除小鼠有前脑至中后脑边界结构部分的缺失[21]。且在缺少Dkk-1调控的小鼠胚胎中，中脑腹神经元存在缺陷，表明Dkk-1在中脑神经分化、形态形成过程中具有重要性[22]。Dkk-1还与BMP等其他基因或信号通路共同协调头部的发育[23,24]。

2.2 Dkk-1的表达与p53介导的神经元死亡的关系

Dkk-1的基因受p53调控[25]。p53是真核细胞中的DNA损伤的主要感受器，在DNA损伤时表达增加，这可能会引起DNA修复或细胞凋亡[26]。因此，一些导致DNA损害的一些损伤能够引起Dkk-1表达增加。在β-淀粉样蛋白处理神经元的培养中，缺乏p53基因可以阻止对Dkk-1表达的诱导作用。Dkk-1虽然不包含在p53调控细胞死亡的经典蛋白之内，但其过度表达使脑肿瘤细胞在DNA烷基化损伤后对凋亡敏感[28]。因此，Dkk-1表达可能与包括神经元死亡在内的DNA损伤过程以及细胞死亡相关。

2.3 Dkk-1在兴奋毒性变性中的作用

谷氨酸盐受体受到过度刺激导致兴奋毒性神经元死亡，并与急性、慢性神经元变性疾病的神经元死亡相关。兴奋性死亡的触发是通过细胞外Ca2+经N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体通道或者缺乏GluR2亚单位的A-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（α-Amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid，AMPA）受体通道扩散，过度流入细胞内[29]。细胞内钙引发一系列的包括凋亡和坏死的毒性反应。Cappuccio等[30]在皮质神经元混合培养中发现，毒性浓度的NMDA可快速诱导Dkk-1表达增加，且这种增加与测得的核β-catenin水平降低相关，这表明在包括功能丧失的机制在内的整个神经元死亡的过程中，Wnt/β-catenin途径这个保护性通路被Dkk-1诱导关闭，在浓度依赖性的方式中，外源添加的Dkk-1可放大NMDA的毒性，也支持Dkk-1在兴奋性中的因果作用。Dkk-1能够激活大鼠海马CA1区内源性谷氨酸盐的潜在毒性。在这个区域局部注入外源性Dkk-1会使Dkk-1具有毒性[31]。

3 Dkk-1与TLE的关系

TLE的发作易导致海马损伤，造成神经元变性、胶质严重增生、异常苔藓纤维发芽、异常海马环路重组、同步兴奋的形成等[32]。

3.1 Dkk-1与癫痫后P53基因表达的关系研究进展

癫痫发作诱导神经元损伤中涉及到不同的病理生理学机制，包括通过红藻氨酸盐和NMDA通道的Ca2+内流增加、氧自由基物质形成和线粒体功能障碍[33]。这些机制聚集引起DNA的损伤，因而产生的P53的表达会激活Dkk-1基因的转录[25]。癫痫发作引起在嗅皮质和海马区神经元死亡，侧脑室注射Dkk-1反义物质可对这两个区域内的神经元发挥近于完全的保护作用。Dkk-1的诱导有助于包括突触持续极度活跃等在内的多种有毒损伤执行细胞死亡程序。

3.2 Dkk-1通过抑制Wnt/β-catenin通路在癫痫中的作用

癫痫发作诱导的神经元损害涉及一种兴奋性损伤[34]，与Dkk-1的诱导相关。给大鼠注射海人藻酸（Kainic acid，KA）致痫后，大鼠出现嗅觉皮质和海马CA1区神经元丢失，并检测到这两个区域的Dkk-1表达增加和核β-catenin的水平下降。将大鼠归类为对KA高、低反应组进行进一步分析，发现在高反应组大鼠中，痫性发作造成严重的神经元死亡，在其海马中可检测到较高水平的Dkk-1。然而，在低反应组大鼠的海马中，未发现Dkk-1水平升高，表明Dkk-1的表达增高与β-catenin核表达减少和神经元死亡有关。锂盐是GSK-3β的抑制物，可激活Wnt/βcatenin通路[35]。Dkk-1敲除和对海人酸癫痫模型鼠用锂盐进行预处理有同样的保护易感神经元的作用，对抗癫痫发作引起的变性，发挥保护性作用[36]。

Dkk-1在成人脑中表达水平非常低[37]，但从海马组织活检和伴或不伴海马硬化的TLE患者的海马的尸检中检测到Dkk-1的表达。在海马硬化患者的组织学中发现Dkk-1的显著表达，这进一步支持Dkk-1在癫痫神经元变性中的重要作用[38]。但是否早期抑制Wnt/β-catenin通路和抑制到什么程度会有助于人体海马硬化的病理生理学过程仍有待进一步研究。

4 Dkk-1作为癫痫的潜在治疗靶点

Dkk-1和Wnt信号分别结合到LRP5/6上的不同的识别位点，Dkk-1拮抗剂可能只干扰Dkk-1与LRP5/6之间的相互作用，而不会破坏Wnt信号结合到LRP5/6[17]，从而不干扰Wnt信号通路的其它的重要生物作用。有研究显示，雌激素（estrogen，E2）作为内源性类固醇激素，能够促进Dkk-1和Wnt信号在脑中的有利的平衡，也可以作为神经保护剂，抑制神经元细胞中的GSK-3β并稳定β-catenin[39]。在生殖衰老的老龄雌性大鼠中，E2长期剥夺导致海马Dkk-1水平升高和β-catenin磷酸化[40]。这些发现可为Dkk-1作为一种新型的癫痫治疗靶点提供依据。

5 总结

TLE作为最常见的神经系统疾病之一，严重神经元丢失、海马神经发生、海马硬化等病理过程在TLE急性期和慢性期的发作中起到关键作用，Wnt/β-catenin通路可以表示这些病理过程与海马潜在改变之间的联系。Dkk-1与Wnt/β-catenin通路之间的相互作用共同调节人体胚胎期神经发育及稳态维持等生理过程，且参与其神经元兴奋性变性等病理过程。Dkk-1敲除或者锂盐治疗，具有确切的神经保护作用。但对于Wnt/β-catenin及其抑制剂Dkk-1在TLE中的具体作用机制，还需进一步研究。推测对Dkk-1的拮抗或许有希望成为TLE的一个候选性治疗。

[1]Wisniewska MB.Physiological role of beta-catenin/TCF signaling in neurons of the adult brain[J].Neurochem Res,2013,38:1144-1155.

[2]Zhang Y,Yuan X,Wang Z,et al.The canonical wnt signaling pathway in autism[J].CNS Neurol Disord Drug Targets,2014,13:765-770.

[3]Huang C,Fu XH,Zhou D,et al.The role of Wnt/beta-catenin signaling pathway in disrupted hippocampal neurogenesis of temporal lobe epilepsy: a potential therapeutic target?[J].Neurochem Res,2015,40:1319-1332.

[4]Guo LM,Song HJ.Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system[J].Ann Rev Neurosci,2005,28:223-250.

[5]VanAmerongen R,Nusse R.Towards an integrated view of Wnt signaling in development[J].Development,2009,136:3205-3214.

[6]Gordon MD,Nusse R.Wnt signaling:multiple pathways,multiple receptors,and multiple transcription factors[J].J Biol Chem,2006,281: 22429-22433.

[7]Cadigan K,Liu Y.Wnt signalling:complexity at the surface[J].Cell Sci,2006,119:395-402.

[8]Milat F,Ng KW.Is Wnt signalling the final common pathway leading to bone formation?[J].Mol Cell Endocrinol,2009,310:52-62.

[9]Inestrosa NC,Arenas E.Emerging roles of Wnts in the adult nervous system[J].Nat Rev Neurosci,2010,11:77-86.

[10]Miller J.The Wnts[J].Genome Biol,2001,3:3001.1-3001.15.

[11]Liu C,Li Y,Semenov M,et al.Control of beta catenin phosphorylation/degradation by a dual-kinase mechanism[J].Cell,2002,108:837-847.

[12]Willert K,Jones KA.Wnt signaling:is the party in the nucleus?[J]. Genes Dev,2006,20:1394-1404.

[13]Garbe DS,Ring RH.Investigating tonic Wnt signaling throughout the adult CNS and in the hippocampal neurogenic niche of BatGal and ins-Top-Gal mice[J].Cell Mol Neurobiol,2012,32:1159-1174.

[14]Fortress AM,Frick KM.Hippocampal Wnt Signaling:Memory Regulation and Hormone Interactions[J]. Neuroscientist, 2015, pii: 1073858415574728.

[15]Fasen K,Beck H,Elger C,et al.Differential regulation of cadherins and catenins during axonal reorganization in the adult rat CNS[J].J Neuropathol Exp Neurol,2002,61:903-913.

[16]Theilhaber J,Rakhade S,Sudhalter J,et al.Gene expression profiling of a hypoxic seizure model of epilepsy suggests a role for mTOR and Wnt signaling in epileptogenesis[J].PLoS One,2013,8:e74428.

[17]Niehrs C.Function and biological roles of the Dickkopf family of Wnt modulators[J].Oncogene,2006,25:7469-7481.

[18]Williams BO,Insogna KL.Where Wnts went:the exploding field of Lrp5 and Lrp6 signaling in bone[J].J Bone Mineral Res,2009,24:171-178.

[19]Nie X.Dkk1,-2,and-3 expression in mouse craniofacial development [J].J Mol Histol,2005,36:367-372.

[20]Niehrs C.Regionally specific induction by the Spemann-Mangold organizer[J].Nat Rev Genet,2004,5:425-434.

[21]Mukhopadhyay M,Shtrom S,Rodriguez-Esteban C,et al.Dickkopf1 is required for embryonic head induction and limb morphogenesis in the mouse[J].Dev Cell,2001,1:423-434.

[22]Ribeiro D,Ellwanger K,Glagow D,et al.Dkk1 regulates ventral midbrain dopaminergic differentiation and morphogenesis[J].PLoS One,2011, 6:e15786.

[23]del Barco Barrantes I,Davidson G,Grone HJ,et al.Dkk1 and noggin cooperate in mammalian head induction[J].Genes Dev,2003,17:2239-2244.

[24]Lewis SL,Khoo PL,Andrea De Young R,et al.Genetic interaction of Gsc and Dkk1 in head morphogenesis of the mouse[J].Mech Dev,2007, 124:157-165.

[25]Wang J,Shou J,Chen X.Dickkopf-1,an inhibitor of the Wnt signaling pathway,is induced by p53[J].Oncogene,2000,19:1843-1848.

[26]Slee EA,O'Connor DJ,Lu X.To die or not to die:how does p53 decide?[J].Oncogene,2004,23:2809-2818.

[27]Caricasole A,Copani A,Caraci F,et al.Induction of Dickkopf-1,a negative modulator of the Wnt pathway,is associated with neuronal degeneration inAlzheimer's brain[J].J Neurosci,2004,24:6021-6027.

[28]Shou J,Ali-Osman F,Multani AS,et al.Human Dkk-1,a gene encoding a Wnt antagonist,responds to DNA damage and its overexpression sensitizes brain tumor cells to apoptosis following alkylation damage of DNA [J].Oncogene,2002,21:878-889.

[29]Zipfel GJ,Babcock DJ,Lee JM,et al.Neuronal apoptosis after CNS injury:the roles of glutamate and calcium[J].J Neurotrauma,2000,17: 857-869.

[30]Cappuccio I,Calderone A,Busceti CL,et al.Induction of Dickkopf-1,a negative modulator of the Wnt pathway,is required for the development of ischemic neuronal death[J].J Neurosci,2005,25:2647-2657.

[31]Scali C,Caraci F,Gianfriddo M,et al.Inhibition of Wnt signaling, modulation of Tau phosphorylation and induction of neuronal cell death by DKK1[J].Neurobiol Dis,2006,24:254-265.

[32]Blumcke I.Neuropathology of focal epilepsies:a critical review[J]. Epilepsy Behav,2009,15:34-39.

[33]Chuang YC,Chang AY,Lin JW,et al.Mitochondrial dysfunction and ultrastructural damage in the hippocampus during kainic acid-induced status epilepticus in the rat[J].Epilepsia,2004,45:1202-1209.

[34]Fuller TA,Olney JW.Only certain anticonvulsants protect against kainate neurotoxicity[J].Neurobehav Toxicol Teratol,1981,3:355-361.

[35]Mastroiacovo F,Busceti CL,Biagioni F,et al.Induction of the Wnt antagonist,Dickkopf-1,contributes to the development of neuronal death in models of brain focal ischemia[J].J Cereb Blood Flow Metab,2009,29: 264-276.

[36]Busceti CL,Biagioni F,Aronica E,et al.Induction of the Wnt inhibitor,Dickkopf-1,is associated with neurodegeneration related to temporal lobe epilepsy[J].Epilepsia,2007,48:694-705.

[37]Diep DB,Hoen N,Backman M,et al.Characterisation of the Wnt antagonists and their response to conditionally activated Wnt signalling in the developing mouse forebrain[J].Brain Res Dev Brain Res,2004,153:261-270.

[38]Caraci F,Busceti C,Biagioni F,et al.The Wnt antagonist,Dickkopf-1,as a target for the treatment of neurodegenerative disorders[J].Neurochem Res,2008,33:2401-2406.

[39]Scott EL,Brann DW.Estrogen regulation of Dkk1 and Wnt/beta-Catenin signaling in neurodegenerative disease[J].Brain Res,2013,1514: 63-74.

[40]Scott EL,Zhang QG,Han D,et al.Long-term estrogen deprivation leads to elevation of Dickkopf-1 and dysregulation of Wnt/beta-Catenin signaling in hippocampal CA1 neurons[J].Steroids,2013,78:624-632.

（本文编辑：王晶）

R741;R741.02;R742.1

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.03.019

哈尔滨医科大学附属第二医院神经内科

哈尔滨 150001

2015-12-08

朱雨岚

ylz_yulan@163. com