诱导痰技术及在支气管哮喘中的应用

肖 伟 综述，刘跃建，龙怀聪 审校

(1.西南医科大学，四川 泸州 646000；2.四川省医学科学院·四川省人民医院 a.呼吸科，b.老年科，四川 成都 610072)

诱导痰技术及在支气管哮喘中的应用

肖 伟1综述，刘跃建2a，龙怀聪2b审校

(1.西南医科大学，四川 泸州 646000；2.四川省医学科学院·四川省人民医院 a.呼吸科，b.老年科，四川 成都 610072)

近10年来，诱导痰技术在医学研究中得到了日益广泛的应用，也为呼吸系统疾病提供了一种简便、无创、安全的检查方法。本文综述了诱导痰技术的方法、诱导痰细胞及液相成份在哮喘研究及临床中的应用。

诱导痰；哮喘；生物标志物；临床应用

诱导痰技术始于1958年，最初是用于诊断肺癌，后来逐渐应用于肺结核、卡氏肺孢子虫肺炎等呼吸道感染性疾病的诊断。1992年Pin等为研究支气管哮喘(简称哮喘)第一次通过改良的方法获得诱导痰。近年来大家对这种通过非侵入性手段获得呼吸道疾病生物标记物的方法，表现出越来越浓厚的兴趣。诱导痰的细胞成分(如嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞)、蛋白质成分(例如粘蛋白和细胞因子)和微生物组分(如病毒和细菌)可以被用作疾病的严重性、急性发作、临床进展以及治疗效果评价的标志物[1，2]。近年来，诱导痰技术作为呼吸道疾病(如哮喘和慢性阻塞性肺疾病)检查的一种手段，正因其无创性、安全性及可重复性越来越受到大家重视。以下就对诱导痰技术及其在哮喘中的应用做一综述，以便大家对其有更加深入的了解。

1 诱导痰的方法

1.1 诱导痰的收集 诱导痰技术是以高渗盐水雾化吸入诱导无痰或少痰患者产生足量痰液，以便对下气道分泌物中的细胞及其他液相成分进行分析研究的一种无创的检测方法。目前常用的诱导方法有两种：①在固定的时间段雾化吸入相同浓度或渐增浓度的高渗盐水。②吸入高渗盐水(4.5%)的浓度不变，逐渐增长吸入时间。诱导方法的选择对痰细胞成分与计数几乎不影响，但痰诱导的持续时间必须保持一致，因为它可能会影响痰中的细胞成分及计数。早期的痰样品中含有更多的粒细胞和单核细胞。诱导痰的时间一般控制在10～20分钟为宜。

不论使用哪种诱导技术，均不是绝对安全的。高渗盐水可引起哮喘患者气道的严重收缩，诱发哮喘发作。因此在操作开始前让患者吸入短效β2受体激动剂，以降低患者对痰诱导的不耐受及危险性。目前已经证实，同一哮喘患者行或不行沙丁胺醇预处理，对诱导痰的细胞成分及计数均无影响[3]。此外，哮喘患者使用支气管扩张剂后一秒用力呼气容积(Forced expiratory volume in one second，FEV1)<65%预测值，建议使用等渗盐水代替高渗盐水。使用高渗或等渗盐水不改变诱导痰的细胞或生化读数[4]。对于缺乏经验的实验室，欧洲呼吸学会Task Force小组推荐的步骤可作为操作的指导。

1.2 痰液的处理 获得痰标本后，应在2小时内进行处理，以减少细胞成分及细胞计数的偏差。然而，放置在冰箱中的样品，在4 ℃下保存，待测时间可适当延长，不会影响细胞学检测，但存放时间不宜超过24小时[5]。目前有两种痰处理方法。第一种方法，选择痰液中黏稠部分。第二种方法是不经选择，将整个痰液及唾液进行处理。将样品放入预称重的聚苯乙烯管中并称重。不经选择的样本加入等体积的二硫苏糖醇(DTT)或经选择的样本加入4倍体积DTT。这是两种方法的不同之处，后续步骤完全一致。DTT打破了粘蛋白分子的二硫键，使细胞分散。用吸管反复吹打样品，然后在涡流混合器中搅拌30秒钟，在37 ℃振荡水浴中振荡10～30分钟。通过48微米尼龙网过滤，滤除粘液和碎屑。过滤后悬液以2000 r/min转速，离心5分钟，以便细胞从上清液中分离。上清液可储存在-70 ℃冰箱中，以备后用。将1%小牛血清PBS缓冲液加入离心沉渣中，使其体积等于离心前。用台盼兰排染法测定细胞活力，计数细胞总数。剩余的细胞混悬液加入细胞涂片离心机中制片并以姬姆萨染色。至少计数400非鳞状上皮细胞，并报告为巨噬细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和支气管上皮细胞的相对数量，表示为总的非鳞状细胞的百分比。鳞状细胞的百分比应单独报告。对两种取痰方法的对比发现选取法优于全选法[6]。

2 诱导痰是研究哮喘的一种重要工具

2.1 诱导痰细胞学 健康受试者诱导痰细胞成分以巨噬细胞[非吸烟组(62.74±12.85)%，吸烟组(57.73±14.37)%]和中性粒细胞[非吸烟组(29.53±18.87)%，吸烟组(39.94±18.52)%]为主，嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、支气管上皮细胞数量较少[7]。哮喘患者和健康受试者相比诱导痰的细胞成分有明显不同。与健康受试者相比，哮喘患者痰中所含的嗜酸性粒细胞数量更多。非类固醇治疗的哮喘患者痰嗜酸性粒细胞比例为0～75%，近一半哮喘患者诱导痰中嗜酸性粒细胞>5%，约17%的哮喘患者诱导痰中嗜酸性粒细胞比例超过20%。相反，在未治疗的轻度到中度哮喘患者中有31%的患者痰液中嗜酸性粒细胞未见显著升高(>2%)[8]。这个结果与肺活检及支气管肺泡灌洗的结果相一致。嗜酸性粒细胞的聚集与激活直接引起气道炎症，在哮喘的发病过程中起着重要作用。虽然痰中嗜酸性粒细胞增多是哮喘的典型特征，但并非所有哮喘患者的诱导痰均相似的细胞分布。在有25%未治疗的成人哮喘及50%糖皮质激素治疗的成人哮喘患者诱导痰嗜酸性粒细胞计数在正常范围[9]。在这些非嗜酸性哮喘患者中有一部分患者痰中中性粒细胞明显升高，特别是哮喘急性发作者。因此，根据诱导痰细胞相对数的不同，哮喘可被分为四种表型：嗜酸性哮喘(嗜酸性粒细胞比例>2%)，嗜中性粒细胞性哮喘(嗜中性粒细胞比例>61%)，混合粒细胞性哮喘(中性粒细胞比例>60%和嗜酸性粒细胞比例>2%)和粒细胞缺乏性哮喘(各种细胞相对数均在正常范围内)[10]。

与粒细胞不同，淋巴细胞的比例相对较少约为1%～2%，很少超过5%。虽然痰中淋巴细胞比例较低，但通过流式细胞术对痰细胞进行详细的分析表明，哮喘患者CD4+T淋巴细胞和表达CD54受体(ICAM-1)的T淋巴细胞的比例增加，而NK细胞比率降低[11]。该研究结果与哮喘的气道炎症由活化的CD4+T细胞调控的概念相一致。哮喘的发生主要是因其机体免疫耐受功能受损，而活化的CD4+T细胞在机体免疫耐受中起着重要的调节作用。

2.2 流体相的生化标志物 诱导痰上清液可测定多种生化标志物。嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)和类胰蛋白酶，作为嗜酸性粒细胞和肥大细胞的活化标志物，均能在哮喘患者诱导痰上清液中提取出，且明显高于健康者，这进一步证实嗜酸性粒细胞增多是哮喘的特征之一[12]。嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)也可以作为哮喘严重程度的一个临床指标，且ECP比嗜酸性粒细胞计数与肺功能更具有相关性[13]。哮喘的另一个基本特征是气道重构。可溶性重构相关蛋白，如胶原蛋白的合成肽、基质金属蛋白酶(MMPs)、基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)和细胞因子，也可在痰上清液检测[14]。诱导痰中还可以检测到多种生长因子，血管内皮生长因子(VEGF)是其中一种，该VEGF及其受体的表达与气道炎症及气道重构具有密切关系。增高的VEGF表达与嗜酸性粒细胞表型哮喘、气流受限及哮喘的严重程度相关联，从而为预防和治疗严重哮喘提供帮助[15]。

3 诱导痰技术在临床实践中的应用及前景

继非特异性支气管高反应性的测定后，痰嗜酸性粒细胞的检测成为诊断哮喘最有效的检查方法。通过测定痰中嗜酸性粒细胞的数量可对哮喘患者吸入糖皮质激素的疗效进行预测。研究显示：嗜酸性粒细胞性哮喘对激素的治疗反应性明显高于中性粒细胞性哮喘[16]。痰嗜酸性粒细胞增多与吸入激素后临床症状改善程度正相关。研究表明：基于痰嗜酸粒细胞的哮喘的治疗能有效地减少哮喘恶化及复发[2]；然而，基于FeNO水平的哮喘治疗，在改善儿童和成人哮喘结果中，并未被证明有效[17]。这可能对临床医师在不久的将来治疗哮喘的策略产生影响，因为这将意味着部分哮喘患者将不能从吸入糖皮质激素治疗中获益。

此外，痰嗜酸性粒细胞也可作为预测哮喘复发的一个指标，Giannini等的研究显示痰嗜酸性粒细胞比例对哮喘症状复发的阳性预测值为71%，而阴性预测值为84%[18]。痰嗜酸性粒细胞计数可以作为气道炎症极好的生物标志物，也可以作为疾病严重程度的标记物。此外痰嗜酸性粒细胞计数(%)也可用于预测哮喘的控制状态[19，20]。并且，痰嗜酸性粒细胞的检测值比另一个哮喘气道炎症的非侵入性标记物NO水平更有意义。

4 总结与展望

近年来诱导痰分析已成为研究呼吸系统疾病气道炎症评估的非侵入性的方法。因诱导痰技术的安全性、无创性、良好的耐受性为该技术的推广奠定了基础。目前，该方法已得到标准化，从而明显提高痰标本的质量及可重复性。但由于诱导痰技术的操作时间及费用问题，限制了其在临床中的广泛应用。更重要的是，虽然诱导痰细胞分析的短期重复性似乎是不错的[21]，但炎性表型不稳定，并且可以自发或随治疗的改变而变化，单一的诱导痰检查不能可靠地预测持续性气道炎症表型[22]。

尽管如此，诱导痰技术仍然值得推广。它不仅可以在气道炎症性疾病如哮喘、慢性阻塞性肺疾病及慢性咳嗽等的诊断、病情评估、疾病监测以及治疗选择中起到重要作用，亦可为肺结核、呼吸系统肿瘤的诊断提供一种安全且耐受性良好的检查手段，为疾病的诊断提供依据[23～24]。

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Induced sputum technique and its application in asthma

XIAO wei1，LIU Yue-jian2a，LONG Huai-chong2b

四川省科技厅科研基金资助项目(编号：2012JY0056)

R562.2+5

B

1672-6170(2016)03-0159-03

2015-12-08；

2016-01-24)