肝癌动物模型研究进展

王冠文，杨爽，张全胜（.重庆医科大学附属第一医院分子肿瘤与表观遗传重庆市重点实验室 重庆 6004；.南开大学医学院 天津 0007；天津市第一中心医院临床重点实验室 天津 009）

在世界范围内肝癌位居恶性肿瘤发病率的第五位，是导致癌症相关死亡的第二大疾病[1]。肝癌易复发和转移，预后效果差，研究表明，肝癌患者肝切除术后5年存活率仅为30%～40%[2]。肝癌的发生是一个多阶段逐步演变恶化的过程。与肝癌发生相关的危险因素包括病毒感染[3]、化学致癌物接触[4]、酗酒[5]等，因此，研究如何提高肝癌诊断，加强预防和改进治疗措施至关重要。动物模型是用来研究肝癌发病机制的重要工具，其中，小鼠模型的应用最为广泛。不同病因可引起不同基因的改变，导致了肝癌的异质性，使得肝癌动物模型不具有普遍性，本文综述了用于研究肝癌的小鼠模型，可供研究者参考。

1 诱发型肝癌动物模型

许多化学致癌物达到足够的使用剂量和时间可以诱发动物形成肿瘤。常用的化学致癌物根据其作用机制可以分为两类：① 诱导DNA结构改变；② 不直接造成肝脏损伤，但是与肝脏毒性药物联合使用时可以增强肿瘤的起始能力。用于构建诱发型肝癌模型常用的化学致癌物包括氨基偶氮染料、芳香胺类、亚硝胺和黄曲霉素等。单用一种化学药物，或多种药物与不同的促癌剂、肝大部分切除等按不同顺序组合成不同的诱发肝癌的方案。

诱发型肝癌模型的优点在于可以模拟肝癌发生的3个过程，即损伤、硬化和肿瘤。其缺点是：诱导周期长（3～5个月，甚至1～2年）、病死率高（53.82%）、肝癌出现的时间、部位、病灶数等在个体之间表现不均一。下面分别介绍几种常用的化学致癌物诱导方法。

1.1 二乙基亚硝胺（DEN）：DEN是一种常用的化学致癌物，不仅可以诱导肝脏肿瘤的发生，同时也可以诱导胃癌[6]、皮肤癌、支气管癌和血液系统肿瘤的发生。DEN的促肝癌作用主要取决于其诱导DNA烷基化的能力，持续使用高剂量DEN可以导致DNA损伤和氧化应激，从而引起肝脏肿瘤的发生。

单独注射DEN诱导肝细胞肝癌（HCC）发生的时间不仅取决于注射剂量，还与动物性别、年龄和品系相关。动物年龄越小，诱导HCC所需的时间越短，因为其肝细胞增殖较快。长期注射DEN时雄鼠肝癌发生率为100%，而雌鼠肝癌发生率仅为30%，这种肝癌发生率的性别差异主要是由于雌激素在HCC中具有抑制作用，而雄激素则是促进作用[7]。

有研究显示，当给2周龄的小鼠单独注射5～90 mg/kg DEN时，在45～104周后可以观察到肿瘤的形成[8]。此外，B6C3F1小鼠单独注射5.0 mg/kgDEN，近 64 周时可以观察到肿瘤的形成[9]，而且在肝癌发生后，短时间内就可以观察到肿瘤肺转移。小鼠品系不同，肝癌发生的时间和概率也不尽相同，例如：给sv129小鼠注射20 mg/kg DEN，30～55周后成瘤率为80%～100%[10]；给C3H/HE小鼠注射90 mg/kg DEN，45～75周后成瘤率为100%[11]；给 C57BL6/J小 鼠 注 射 5 mg/kg DEN，40～70周后成瘤率为84%。此外，还可以联合注射苯巴比妥（PB）和DEN，其中，PB作为促癌剂，可以缩短建模时间。

1.2 黄曲霉素B1（AFB1）：AFB1是黄曲霉菌、寄生曲霉菌等产毒菌株产生的次生代谢产物。霉变食物中AFB1最常见，是目前已知最强的化学致癌物之一。AFB1在进入人体后经肝脏内CYP450酶系统作用活化为AFB1-8，9-环氧化物（AFBO）[12]，继而与DNA鸟嘌呤结合形成加合物，改变DNA结构，引起DNA化学损伤。有研究结果显示，给1周龄的小鼠喂食6 mg/kg的AFB1，52周后可诱导肝癌的形成[13]。

1.3 四氯化碳（CCl4）：CCl4的肝脏毒性可分为两个阶段[14]，首先，CCl4在肝内经细胞色素P450代谢产生自由基，自由基引起脂质过氧化反应，造成细胞膜损伤；其次，CCl4可引起肝巨噬细胞（库普弗细胞）诱导的炎症反应应答，导致炎症因子、趋化因子和其他促炎因子的分泌，这些因子不仅能够直接造成肝脏的毒性损伤，而且能激活单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞，最终导致肝组织损伤。反复的损伤、炎症、修复最终可导致肝纤维化和肿瘤的形成[15]。小鼠出生6周后开始静脉注射CCl4（10 μl/g CCl4溶解于10%橄榄油），每周注射3次，4个月后能够发生肿瘤。

2 移植肝癌动物模型

移植肝癌动物模型是指将肝癌组织或细胞（源于动物或人）移植到受体动物体内（肝脏、肝外组织或器官）或将非肝脏来源的恶性肿瘤如乳腺癌等移植到动物的肝脏。人类肿瘤移植瘤的来源有肿瘤活检组织、手术切除标本、取自肿瘤患者的胸腹腔积液内的肿瘤细胞和人类肿瘤细胞系。移植肝癌动物模型主要用于筛选临床抗癌药物。这种方法的优点在于可以使一组动物同时接种同样量的肿瘤组织和细胞，其肿瘤细胞生长速率比较一致，肿瘤的大小和位置较易控制，个体差异较小，接种成活率接近100%。对宿主的影响相类似，易于客观判断疗效，可在同种或同品系动物之间进行连续移植，试验周期一般较短，试验条件易于控制。根据受体动物的不同，移植肝癌模型可分为正常动物移植性肝癌模型和免疫缺陷动物移植性肝癌模型。

2.1 皮下移植瘤模型：在HCC的研究中，皮下移植瘤模型是最常用的模型。这个模型将人肝癌细胞或肿瘤组织种植到免疫功能缺陷小鼠的颈背部皮下，种植的肿瘤细胞数为（1～5）×106个时，成瘤率接近100%。由于肿瘤组织更完整地保留了人肝细胞癌的特性，因此，应用此动物模型所得到的实验结果较为可靠[16]。

皮下移植瘤模型在很多方面的试验中得到了广泛运用。但是，它最主要的缺点是缺乏肿瘤和肝组织之间的相互反应，缺乏肿瘤与宿主的相互关系，在药物试验中可能产生大量假阳性结果。另外，微环境的改变可能会影响恶性细胞的生物学行为。例如，当在皮下接种HCC细胞时，远处转移现象很少发生，而原位接种却经常发生远处自发转移[17]。

2.2 原位移植瘤模型：建立原位移植瘤模型包括两种途径，一种方法是建立肝内种植模型，即将患者或皮下移植瘤模型来源的肿瘤碎片切割成1 mm×1 mm×1 mm的碎片，然后将其植入免疫功能缺陷小鼠的肝内[18]；另一种更为常用的方法是将肿瘤细胞悬浮于10～20 μl含有50%基质胶的无血清培养基中，直接注射到小鼠的肝左叶，约1周后将形成肝肿瘤[19]。建立原位移植瘤模型需要的细胞数目为（1～5）×106个时可形成远处转移。但由于不同HCC细胞系的转移能力不同，远处转移灶出现所需要的时间也有差别。

原位移植瘤模型在模仿肿瘤微环境方面优于皮下移植瘤模型，其主要缺点在于必须处死小鼠后才能测量肿瘤的体积[20]。

2.3 异体移植模型：近年来的研究显示，对于HCC患者来说，免疫疗法可能成为其有效的选择，特别是对于肿瘤复发的患者[21]。在这样的情况下，免疫功能缺陷小鼠不适于模型构建，因此，将小鼠HCC细胞系或肿瘤组织植入具有免疫活性的小鼠中建立异体移植模型则至关重要。由于免疫疗法的最佳对象为复发HCC的患者，研究人员通常将低剂量的肿瘤细胞注射入门静脉或脾静脉[22-23]。例如，Zhao等[24]将1×106个小鼠肝癌细胞（H22）以及2×105个肝星状细胞（HSCs）同时注射入BALB/c小鼠的肝脏内，激活的HSCs不仅能够诱导肿瘤血管的新生和淋巴管生成，还可以显著激活免疫抑制细胞，从而促进肝癌的发生和发展。因此，异体种植模型在某些特定的研究领域中为我们提供了更多的选择。然而，由于小鼠肝肿瘤不同于人类肝肿瘤，临床现象与实验结果是否相符尚需进一步研究证实。

3 转基因动物肝癌模型

转基因动物是指通过基因工程的方法将特定的外源基因导入动物基因组内，使其发生整合、遗传繁殖，由此培养出携带外源基因的动物。此模型不但能从动物整体的组织器官水平上进行研究，而且还可以深入到细胞和分子水平，为肝癌的发病机制、药物筛选和临床医学研究提供了理想的实验体系。

3.1 组成型表达系统：组成型转基因小鼠是将外源DNA片段导入到小鼠受精卵中，当胚胎发育成小鼠时，其所有细胞中都可以表达目的基因，并稳定的遗传给后代。

乙型肝炎病毒（HBV）感染是引起HCC的主要原因之一。HBV的组成成分中研究最多的是乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）和乙型肝炎病毒表面抗原。完全整合了HBx基因的转基因小鼠，其肝脏的组织病理呈进展性变化，第4个月时出现多灶性肝细胞改变，第8～10个月时出现良性腺瘤。80%以上的雄鼠在第11～15个月时死于肝癌，60%以上的雌鼠在第17～21个月时死亡。组成型基因表达系统最主要的缺点之一就是胚胎致死。另外，外源基因是随机整合的，整合率并不能控制，而且这种技术使得基因表达通常不局限于某个器官或某个组织，基因的表达量和表达时间均不受控制，因此，无法回答基因功能上的许多细节问题。

3.2 条件性表达系统：Cre/loxP重组系统被广泛应用于条件性基因表达系统。Cre/loxP重组系统由Cre重组酶和loxP位点两部分组成。loxP由两个13 bp反向重复序列和中间间隔的8 bp序列共同组成，其中13 bp反向重复序列是Cre重组酶的结合域。Cre重组酶是细菌噬菌体P1的一种酶蛋白，分子量约为38 KDa，可以识别催化两个LoxP位点之间发生同源重组，从而造成DNA的缺失、异位等现象。如果两个LoxP位于同一条DNA链上，且方向相同，结果将使LoxP位点之间的序列被删除，条件性表达系统因具备上述特点而被广泛应用于条件性基因表达系统。当Cre酶启动子为组织特异性启动子时，可以使目的基因只在特定的组织中表达。在条件性系统中，常常利用某些肝脏特异性的启动子元件，如清蛋白（Alb）启动子[25-26]、金属硫蛋白（MT）启动子[27]、甲状腺素运载蛋白启动子等，实现目的基因在肝脏中的特异性表达。为了研究c-myc与转化生长因子-α（TGF-α）在肝癌发生中的相互作用，Sandgren等[28]构建了Alb/c-myc和MT/TGF-α两种小鼠转基因模型[27]，进而建立了c-myc/TGF-α转基因小鼠模型，研究结果发现，与单独表达Alb/c-myc或MT/TGF-α的转基因小鼠相比，c-myc和TGF-α基因在小鼠肝脏中的共同表达会导致肝脏肿瘤的形成加速[29]。这种转基因小鼠出生后第1周，肝细胞持续增殖，2月后即可形成肿瘤。

条件性表达型系统可以避免发生胚胎致死，但其主要缺点在于这种不可逆的方法并不能准确地模拟癌基因在肿瘤发生发展的不同阶段所发挥的作用。

3.3 诱导型基因表达系统：诱导型基因表达系统允许我们在短时间内控制基因表达的变化。目前，常用的可诱导系统包括三类，分别是四环素调控基因表达系统、他莫昔芬调控基因表达系统以及病毒调控的Cre传递系统。其中四环素调控系统包括：tet-off和tet-on系统，它们都是在原核生物操纵子模型的基础上建立起来的真核诱导型基因表达系统。Tet-off系统由反应质粒和调节质粒组成。调节质粒的启动子是人巨细胞病毒启动子，下游是一段由四环素阻遏蛋白（TetR）与单纯疱疹病毒 （HSV）的VP16蛋白羧基末端的转录激活区融合而成的转录活化因子（tTA）。在反应质粒上克隆目的基因，反应质粒的启动子是缺失了增强子的人巨细胞病毒最低限度启动子（PminCMV），其上游是一个由操纵基因（TetO）和42个碱基的7次正向重复序列组成的。由于PminCMV缺失增强子区需要TetR与TetO结合，目的基因才能启动表达。当四环素不存在时，调节质粒表达产物TetR能与反应质粒TRE区的TetO序列结合，能够启动下游目的基因的转录和表达；当四环素存在时，tTA与TetO分离，目的基因不能被转录。tet-on系统是在tet-off系统的基础上改造发展而来，将tet-off系统调节质粒中的转录因子换成四环素调控的反式激活子（rtTA），当四环素衍生物强力霉素（Dox）不存在时，rtTA不能识别其特异的DNA靶序列，目的基因不表达；当Dox存在时，rtTA才能够与TetO序列结合从而启动目的基因的转录。

Tet调节系统的优点包括：① 可以在大范围内极其严格地行使调控作用；② 定量控制表达所需要的四环素浓度远远低于毒性阈值；③ 由于四环素具有良好的细胞和组织穿透能力，即使在小鼠的不同部分，包括胎盘以及哺乳母鼠的乳汁中，所需浓度可以轻易实现。因此，Tet调节系统可以用于发育中的胚胎以及离乳前和离乳中的小鼠后代[30]。使用组织特性启动子，辅以四环素调控系统。利用四环素控制Cre细胞谱系特异性的表达，通过Cre重组酶催化的重组作用可在特定组织及特定发育阶段敲除由LoxP序列标记的基因。病毒调控的Cre传递系统是另一种基因操纵方式。在这个系统中，缺失复制功能的重组腺病毒可被用于将肝特异性Cre基因转入携带loxP序列的小鼠中[31]。Colnot等[32-33]建立了一种小鼠模型，在其抑癌基因Apc的第14个外显子两侧加入了loxP位点（Apclox/lox），之后通过静脉注射腺病毒编码的Cre重组酶（AdCre） 使肝脏Apc基因失活。注射0.5×109滴度的AdCre 8个月之后，67%的Apclox/lox小鼠出现了HCC。在这些Apc基因失活的HCC小鼠中，β-catenin信号被明显激活。

与其他可诱导系统相比，腺病毒调控的表达系统更容易实施，相对技术难度较低。更重要的是，研究人员不仅可以实现准确的临时调控，还可以精确调节特定基因的表达水平。然而，腺病毒无法整合到宿主的染色体中，故无法实现基因的稳定表达。

4 展 望

随着人们对肝癌临床和基础研究的日益深入，通过基因打靶技术结合体细胞克隆技术、核酸干扰技术等可以将离体培养、基因敲除或基因定点修饰后的动物体细胞转变成动物个体，这将很好地解决动物转基因效率低和基因表达方面的问题，为肝癌动物模型提供发展方向。此外，进一步利用基因技术或其他科学方法，使肝癌动物模型的建立不断改进和完善，能够为肝癌的基础理论和临床应用研究提供更理想的动物模型。