动脉化小鼠肝移植模型

张全胜，田英华（.天津市第一中心医院器官移植中心，天津市器官移植重点实验室 天津 3009；.瑞士苏黎世大学附属医院）

随着临床肝脏移植的飞速发展，科学家迫切需要建立合适的动物肝脏移植模型，从基础科研角度解决瓶颈问题。小鼠因其解剖生理与人类相似（与大鼠相比，小鼠有胆囊而大鼠无胆囊），而且小鼠的H2系统也与人类白细胞抗原（HLA）系统相似。加上人类对小鼠基因型了解得比较透彻，近十年来，已经成功建立了基因敲除和转基因小鼠模型，并研制了大量相应的特异性单克隆抗体，为肝移植术后免疫学的动物实验研究提供了近于完美的实验品系。因此，利用小鼠来建立动物肝脏移植模型成为器官移植基础科研工作的首选。

1991年Qian等[1]首次成功建立了非动脉化小鼠原位肝移植（OLT）模型。但非动脉化的动物模型明显与临床肝移植的生理过程有所差异。临床实践中发现，肝动脉系统是供肝侧胆管及吻合口最主要的血供来源，肝动脉重建的重要性不言而喻。移植术后早期发生的肝动脉血供不良（HAI）是移植术后缺血型胆管损伤（ITBL）和致死性胆道并发症的独立性危险因素，严重影响受体再次肝移植率和存活率[2]。李永辉等[3]通过单纯结扎正常小鼠肝动脉的实验发现其术后肝功能明显异常，肝出现缺血性改变，尤其胆管病变明显，胆管坏死增生，发生急性胆管炎，并可致肝内感染，脓肿形成甚至死亡，说明结扎肝动脉可危及小鼠生命。动脉化的OLT模型因更接近于自然生理而受到广泛关注。

总结大鼠和小鼠肝移植动脉化模型发现，多数研究人员认为大鼠的动脉重建成功与否与大鼠移植术后的灌注损伤、长期生存率、胆道并发症的发生没有必然联系[4]。但小鼠的情况却与之不同，多数研究人员认为小鼠肝移植的动脉化相较于非动脉化具有以下几个方面的优势：

1 动脉化有利于减少肝细胞损伤及胆道并发症

1.1 反映肝细胞受损情况的丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST），非动脉化OLT模型术后1周内的表达明显高于动脉化OLT模型。

1.2 碱性磷酸酶（ALP）是反映胆道上皮损伤情况的酶学指标，动脉化OLT模型术后ALP升高不明显，而非动脉化OLT模型术后2周ALP明显升高，且持续时间长[5]。

1.3 动脉化和非动脉化OLT模型的常规病理明确提示，非动脉化OLT模型术后1周可见肝细胞散在点、片状坏死，汇管区可见淋巴细胞浸润，上皮细胞凋亡，轻度纤维化，伴小胆管增生。术后1个月汇管区小胆管明显增生，极性紊乱，胆管上皮细胞增生，胆汁淤积，大体标本肝脏内可见明显淤胆，不同程度的阶段性胆道梗阻与扩张。而动脉化OLT模型术后1个月可见肝组织结构良好，肝小叶结构完整，肝细胞大小正常，染色均匀，偶见少量纤维组织增生，汇管区少量淋巴细胞浸润，小管增生不明显，无胆汁淤积。可见肝动脉重建有利于肝功能恢复，减少肝细胞损害和胆道并发症。

2 能够减轻器官保存引起的灌注损伤，延长供肝保存时间

Que等[6]报道显示，供体冷保存长达16小时的非动脉化小鼠肝移植模型，术后生存不超过2天。而Tian等[5]研究发现，在同等条件下，动脉化OLT模型能稳定的长期生存。据此，Shen等[7]设计了器官不同冷保存时间的实验方案，以1小时、6小时、16小时、24小时来分别统计动脉化/非动脉化模型术后2周的存活率，结果发现动脉化小鼠模型存活率分别为100%、100%、47%和33%，而非动脉化的存活率仅为92%、82%和8%。研究人员又针对24小时冷保存的器官移植术后进行分组，观察术后1小时、6小时和1天、3天、7天存活率，结果显示动脉化模型存活率分别为100%、66%、45%、41%和31%，高于非动脉化模型的100%、44%、26%、15%和11%。可见对于长时间冷保存的供体肝脏来说，动脉化OLT模型的术后存活率优于非动脉化OLT模型。目前，能够解释该现象的理论依据还不是十分明确，有学者注意到与动脉化模型相比，非动脉化模型术后CD4+表达明显升高，从而增强了白细胞介素-2（IL-2）、γ干扰素、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞炎症因子的产生和释放，加重了非动脉化模型的肝细胞损伤[7]。

3 提高术后长期存活率

Qian等[1]最早报道的非动脉化小鼠肝移植模型研究指出，该模型的长期预后并不理想，术后2周存活率为70%～80%，术后3周存活率不超过60%。相反，Tian等[5]却发现小鼠动脉化的OLT模型能保持较好的长期存活率，认为这得益于动脉重建带来更轻的炎症发应、更小的肝细胞损伤、能保持更完整的胆道形态，从而有利于小鼠肝功能的恢复，因而得以长期存活。

也有少数学者认为动脉重建对于小鼠肝移植模型术后受体的存活率和胆道并发症无显著性影响，而且IL-2、γ干扰素、TNF-α的基因表达水平也没有显著差异[8]，因而，对于由此产生的炎症反应无明显影响。这一问题，还需要今后更多的实验来深入研究。

实际操作中，小鼠的动脉壁纤薄，吻合方式多统一采取11-0无损伤血管缝线两点连续缝合方式。但供体动脉吻合端的选择有两种不同方式：① 国内外大多数学者采用供体肠系膜上动脉襻与受体腹主动脉进行端侧吻合的方法[5]；② 但也有学者认为这样供体血管较短，在受体左肾动脉下腹主动脉吻合时肝动脉受到牵拉，影响肝动脉血流。研究人员对此提出了改进意见，将肝动脉连同腹腔干及其以下的一段腹主动脉作整段取出，然后将供、受体腹主动脉进行端侧吻合，增加了供体血管长度，也增大了吻合血管的口径，减少了并发症[9]。还有学者报道采用肝固有动脉支架法重建动脉。但这一方法不可避免的形成继发血栓。术后2周检查肝动脉通畅情况时发现，21%受体鼠的动脉支架附近有明显的血栓形成[10]。

与人的解剖结构相似，小鼠的肝动脉也存在变异，而肝动脉变异对肝动脉重建造成不同的影响。常见的变异发生在肝动脉起源于肠系膜上动脉或胃左动脉（＜10%），但并不影响随后的动脉重建，但其他一些很罕见的变异，例如肝固有动脉直接由腹主动脉发出、或由食管支发出、或肝左动脉单独由胃左动脉发出（＜2%），如果出现上述情况，最好的办法是另选供体[5]。

综上所述，小鼠OLT模型的动脉化有利于减少肝细胞损伤及胆道并发症；能够减轻器官保存引起的灌注损伤，延长供肝保存时间；提高术后长期存活率。但该模型技术难度较大，到目前为止，世界上只有少数研究中心能够完成。这需要充分的实验条件准备、严格的显微外科操作训练和极大的耐心，才能知难行易。