诱导性多能干细胞及体细胞转分化技术治疗多发性硬化的研究进展

李 梅，谢 冲， 2，管阳太

1. 第二军医大学附属长海医院神经内科，上海 200433；2. 上海交通大学医学院附属仁济医院神经内科，上海 200127



综述Review

诱导性多能干细胞及体细胞转分化技术治疗多发性硬化的研究进展

李 梅1，谢 冲11， 2，管阳太

1. 第二军医大学附属长海医院神经内科，上海 200433；
2. 上海交通大学医学院附属仁济医院神经内科，上海 200127

摘要

关键词：多发性硬化；诱导性多能干细胞；转分化

李 梅，谢 冲，管阳太. 诱导性多能干细胞及体细胞转分化技术治疗多发性硬化的研究进展［J］. 神经病学与神经康复学杂志，2016， 12（1）:24–28.

FUNDlNG/SUPPORT: Key Project of National Natural Science Foundation of China （No. 81230027）； General Project of National Natural Science Foundation of China （No. 81471219）； Outstanding Academic Leaders Planning of Shanghai Municipality （No. 14XD1403400）

CONFLlCT OF lNTEREST: The authors have indicated they have no conflicts of interest to disclose.

Received Feb. 22， 2016； accepted for publication Mar. 1， 2016

Copyright © 2016 by Journal of Neurology and Neurorehabilitation

GUAN Yangtai

E-MAIL ADDRESS

yangtaiguan@sina.com

ABSTRACT

Multiple sclerosis （MS） is the most common inflammatory demyelinating disease of central nervous system and remains one of the major causes of disability in young adults. Conventional therapeutics can only prolong the remission duration， but do not cure it. Induced pluripotent stem cells （iPSCs） with the same totipotent differentiation as the stem cells have a broad prospect for application of cell replacement therapy in MS. Somatic cell reprogramming and transdifferentiating can shorten the time for generating oligodendrocyte cell lineage， as compared with the traditional method with iPSCs， which provides a new idea for the treatment of MS. With the improved efficiency and quality in obtaining neural stem cells and oligodendrocytes， it is possible to have a big achievement in cell therapy for MS.

To cite: Ll M， XlE C， GUAN Y T. Advances in treatment with induced pluripotent stem cells and somatic cell transdifferentiation for multiple sclerosis. J Neurol and Neurorehabil， 2016， 12（1）:24–28.

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病，病变累及中枢神经系统白质，成为青壮年致残的主要原因。目前MS的治疗方法主要包括复发治疗、疾病修饰治疗和对症治疗［1-3］。大量证据显示，MS患者致残的主要原因是永久性髓鞘脱失和大量轴突损伤，因此MS的理想治疗应包括免疫调节和神经保护。干扰素β、芬戈莫德和那他珠单抗等药物可减慢疾病进程以及降低复发危险，但不能修复髓鞘以及神经元细胞［4-10］。由此可见，基于目前的治疗方法并不能完全治愈MS，因此探寻新的治疗手段显得尤为必要。本文综述了诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）与转分化技术在MS治疗中的研究现状及其临床应用前景。

1 诱导性神经干细胞

2006年，TAKAHASHI等［11］利用病毒载体将转录因子（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc）组合转入小鼠皮肤成纤维细胞中，通过重编程得到类似于干细胞的多能干细胞，即iPSCs。这种重编程细胞与胚胎干细胞相似，可分化为3个胚层细胞的所有细胞类型。将iPSC来源的神经干细胞和少突胶质前体细胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs）移植入实验性变态反应性脑脊髓炎（experimentally allergic encephalomyelitis，EAE）老鼠模型以及其他脱髓鞘动物模型时，可以观察到残疾状态的改善以及髓鞘的再生［12-13］。AASEN等［14］发现，可以从健康者及患者身上建立人类来源的iPSCs；这一技术的出现，拉近了干细胞与临床疾病治疗的距离［14-16］。iPSCs研究成功解决了长期困扰胚胎干细胞研究的伦理学及免疫排斥问题，具有广泛的临床应用价值，成为近年来干细胞研究领域最令人瞩目的一项新兴干细胞制造技术。下文即探讨iPSCs通过分化成少突胶质细胞，对EAE及其他脱髓鞘模型的治疗作用。

1.1iPSCs体外分化成少突胶质细胞谱系

iPSCs可最终分化成少突胶质细胞，进行髓鞘形成和修复，这是MS治疗的基础。2010年，TOKUMOTO等［17］对iPSCs和胚胎干细胞的分化能力进行了比较，其最终分化的细胞谱系群内均有A2B5标记的OPCs以及特异性标志物O4阳性的少突胶质细胞，表明IPSCs和胚胎干细胞相似，均有分化成少突胶质细胞的潜能。2011年，OGAWA等［18］利用表皮生长因子的协同作用，首次将健康人iPSCs分化为O4阳性的少突胶质细胞。SONG等［19］证实，来自复发缓解型和进展型MS患者的纤维细胞亦可经重编程获得iPSCs，最终分化成具有正常核型的神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞，且此种由iPSCs分化而来的神经细胞具有正常的神经电生理功能。这一研究结果表明，MS来源的iPSCs最终亦可分化成功能神经细胞，为实现MS的个体化治疗提供了更多可能［19］。

1.2iPSCs来源的神经干细胞对EAE的疗效

鉴于已明确室管膜下区和骨髓来源的神经干细胞的疗效［20-21］，因此对iPSCs来源的神经干细胞是否具有相似的疗效进行了系列研究。LATERZA等［12］给予髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG）诱导的EAE小鼠鞘内注射iPSC来源的神经干细胞后，小鼠临床残疾评分较对照组明显下降，退化性病变及脊髓轴突损害程度明显减轻。然而，此研究也发现，在体外培养时，大部分iPSCs来源的神经干细胞并不能分化成少突胶质细胞，表明其并不直接参与髓鞘再生［12］。进一步的研究证实，iPSCs来源的神经干细胞可以通过分泌神经营养因子，如白血病抑制因子等，促进内源性髓鞘细胞分化。此外，神经干细胞调控的营养作用可维护血脑屏障的完整性，使炎性反应局限于中枢神经系统。中枢神经系统的炎性反应可导致髓鞘受损，而iPSCs在炎性环境中仍可发挥神经保护及营养作用，因而iPSCs在MS的治疗领域中具有广阔的应用前景［18］。

1.3iPSCs来源的OPCs对其他脱髓鞘模型的疗效

对脱髓鞘模型进行干细胞移植治疗时，常见的可供移植的细胞除iPSCs来源的神经干细胞以外，另一种就是iPSCs来源的OPCs。在cuprizone诱导的脱髓鞘小鼠模型的胼胝体部位注射iPSCs来源的OPCs，后者可分化成髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）阳性少突胶质细胞，进而促进胼胝体轴突的髓鞘再生［22］。POUYA等［23］证实，给予卵磷脂诱导的小鼠视交叉脱髓鞘模型注射人类来源的iPSCs-OPCs后，luxol fast blue染色显示髓鞘再生，视觉诱发电位检查也显示视力改善。由此表明，移植的iPSCs-OPCs可以分化成少突胶质细胞，并在视交叉处聚集，继而促进髓鞘再生以及功能的恢复［23］。

给予震颤性小鼠（一种先天性髓鞘发育不良的遗传模型）注射iPSCs来源的OPCs 9个月后，发现小鼠的生存状态得到明显改善，且死亡率有所降低［12］。DOUVARAS等［24］将MS患者来源的iPSCs分化而来的OPCs注射入震颤性小鼠体内16周后，观察到人MBP阳性少突胶质细胞广泛分布于胼胝体，约30%的小鼠出现髓鞘形成。这些结果表明，iPSCs来源的OPCs在活体内亦有髓鞘再生的能力［24］。有研究发现，p27过表达可提高iPSCs来源的OPCs最终分化成O4阳性少突胶质细胞的分化率［25］。上述研究均证实，iPSCs来源的OPCs可形成和修复髓鞘，却不能沿着轴索进行迁移［22］。CZEPIEL等［26］利用慢病毒转导方式过表达突触融合蛋白（syntaxin，STX），然后将STX转染的OPCs移植入cuprizone诱导的脱髓鞘小鼠模型3周后，发现OPCs分布于胼胝体中，其迁移能力较对照组显著增强。iPSCs的出现是新型再生医学开创性的发现，但从体细胞至最终的少突胶质细胞，须经重编程以及后续再分化等阶段。因此，有必要探寻是否可将体细胞直接转分化成特定的少突胶质细胞谱系。

2 转分化技术

转分化是指一种类型的细胞或组织在某些理化因素作用下转变为另一种正常细胞或组织的现象。目前的研究主要集中于体细胞在某些因子作用下转分化为诱导性神经干细胞（induced neural stem cells，iNSCs）和诱导性少突胶质前体细胞（induced oligodendrocyte progenitor cells，iOPCs）。

2.1iNSCs

2011年，KIM等［27］首次证实，在正常神经干细胞培养条件的基础上加入重编程因子（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc）可使小鼠成纤维细胞转化为iNSCs，而iNSCs最终可特异性分化成神经元细胞和星形胶质细胞，但此种分化而来的细胞只可更新3～5代。随后，THIER等［28］证实在小鼠成纤维细胞重编程的初始阶段抑制OT4的活性，并导入Sox2、Klf4和c-Myc等转录因子，可使转分化的iNSCs自我更新超过50代。此外，RING等［29］发现，通过转录因子Sox2，可使成纤维细胞直接重编程为iNSCs，并最终分化成成熟的星型胶质细胞和少突胶质细胞，且无成瘤性，故相较于iPSCs分化而来的神经干细胞，其安全性更高。有研究在新生震颤性小鼠的脑组织中注射入增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，eGFP）阳性标记的iNSCs；10周后，可在小脑白质纤维束部位观察到eGFP阳性和MBP阳性的髓鞘组织［30］。该研究结果表明，iNSCs可分化成少突胶质细胞参与髓鞘再生［30］。2015年，HAN等［31］首次证实可以直接通过联合使用丙戊酸、RG108、PD0325901、CHIR9901和维生素C等小分子物质，使小鼠成纤维细胞转分化为iNSCs；与以往的研究相比，由于无需外源性转录因子和病毒载体，其安全性更高，从而为临床上MS的个体化治疗提供了更多的可能［31］。

2.2iOPCs的研究进展

NAJM等［32］发现，过表达8种或3种转录因子可使小鼠成纤维细胞重编程为iOPCs，从而避免使用iPSCs技术。该机制表明，这8种（Olig1、Olig2、Nkx2.2、Nkx6.2、Sox10、ST18、Gm98 和Myt1）或3种（Nkx6.2、Sox10和Olig2）转录因子可诱导成纤维细胞表达OPCs的基因，进而分化成典型的少突胶质细胞［32］。YANG等［33］的研究也表明，可通过3种转录因子（Sox10、Olig2和Zfp536）诱导鼠纤维细胞转化为iOPCs；在其注射部位可发现MBP阳性细胞形成的管状结构包裹在轴索周围；超微结构分析可观察到髓鞘形成。最近，有研究证实可以通过单个转录因子（Oct4）使脊髓受损小鼠模型的成纤维细胞重编程转化成iOPCs，而Oct4-iOPCs具有双能性，经体内外培养可最终分化为星形胶质细胞和少突胶质细胞，其与野生型OPCs的基因表达谱相似，且无致瘤性。这些研究结果表明，经体细胞直接转分化而来的iOPCs最终均可分化成少突胶质细胞，参与髓鞘形成及神经细胞再生［34］。

目前的研究尚未涉及iNSCs和iOPCs对EAE模型的疗效，但仍有理由相信相较于其他干细胞疗法，转分化而来的细胞疗法有其独特的优势。之所以如此认为，是因为多项研究已证实iOPCs 和iNSCs在体内外均具有髓鞘修复能力；其次，此种转化方式简单，人力和物力的耗费也更少；最后，其他干细胞的来源大多是胚胎干细胞及脐带血干细胞，而iOPCs和iNSCs是由体细胞转化而来的，在MS的个体化治疗方面，是最合适的选择。关于iOPCs和iNSCs应用于EAE甚至MS临床治疗的疗效，仍有待进一步研究。

3 展 望

鉴于iPSCs获得方法简单、稳定，无需使用卵细胞或胚胎，因此在技术和伦理学层面更具优势；但iPSCs的产生效率低、实验耗时长、移植存活率也较低，且如何避免iPSCs的致瘤性等仍是MS治疗所面临的最大难点。通过转分化技术另辟蹊径，在简化繁琐实验过程的同时，可以避免细胞治疗中的脱靶效应。然而，相关技术的研究还很有限，仍存在较多的问题，如病毒载体可能引发的安全问题、处理的时机和时序以及量效关系等，都有待通过探求新的、不借助病毒对细胞进行重编程的媒介予以解决。上述研究目前多局限于动物模型阶段，还未正式应用于MS的临床治疗。相信随着研究的不断深入，对iPSCs及体细胞转分化技术利弊的认识也会日益清晰，这些均为细胞治疗应用于MS的治疗提供了有利的条件。

参考文献

［1］ POLMAN C H， RElNGOLD S C， BANWELL B，et al. Diagnostic criteria for multiple sclerosis: 2010 revisions to the McDonald criteria［J］. Ann Neurol， 2011， 69（2）: 292–302.

［2］ POSER C M， BRlNAR V V. Diagnostic criteria for multiple sclerosis［J］. Clin Neurol Neurosurg， 2001， 103（1）:1–11.

［3］ POLMAN C H， RElNGOLD S C， EDAN G， et al. Diagnostic criteria for multiple sclerosis: 2005 revisions to the“ McDonald Criteria”［J］. Ann Neurol， 2005， 58（6）:840–846.

［4］ KHAN O A， TSELlS A C， KAMHOLZ J A， et al. A prospective， open–label treatment trial to compare the effect of lFN beta–1a （Avonex），lFNbeta–1b （Betaseron）， and glatiramer acetate （Copaxone） on the relapse rate in relapsing–remitting multiple sclerosis［J］. Eur J Neurol， 2001， 8（2）:141–148.

［5］ SANDBERG–WOLLHElM M， BEVER C， CARTER J， et al. Comparative tolerance of lFN beta–1α regimens in patients with relapsing multiple sclerosis. The EVlDENCE study［J］. J Neurol， 2005， 252（1）:8–13.

［6］ KAPPOS L， RADUE E W， O’CONNOR P， et al. A placebo–controlled trial of oral fingolimod in relapsing multiple sclerosis［J］. N Engl J Med， 2010， 362（5）:387–401.

［7］ CALABRESl P A， RADUE E W， GOODlN D，et al. Safety and efficacy of fingolimod inpatients with relapsing–remitting multiple sclerosis （FREEDOMS ll）: a double–blind，randomised， placebo–controlled， phase 3 trial［J］. Lancet Neurol， 2014， 13（6）:545–556.

［8］ MlLLER D H， KHAN O A， SHEREMATA W A，et al. A controlled trial of natalizumab for relapsing multiple sclerosis［J］. N Engl J Med，2003， 348（1）:15–23.

［9］ POLMAN C H， O’CONNOR P W， HAVRDOVA E， et al. A randomized， placebo–controlled trial of natalizumab for relapsing multiple sclerosis［J］. N Engl J Med， 2006，354（9）:899–910.

［10］ CHAHlN S， BALCER L J， MlLLER D M， et al. Vision in a phase 3 trial of natalizumab for multiple sclerosis: relation to disability and quality of life［J］. J Neuroophthalmol， 2015，35（1）:6–11.

［11］ TAKAHASHl K， YAMANAKA S. lnduction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors［J］. Cell， 2006， 126（4）:663–676.

［12］ LATERZA C， MERLlNl A， DE FEO D， et al. iPSC–derived neural precursors exert a neuroprotective role in immune–mediated demyelination via the secretion of LlF［J］. Nat Commun， 2013（4）:2597.

［13］ WANG S， BATES J， Ll X， et al. Human iPSC–derived oligodendrocyte progenitor cells can myelinate and rescue a mouse model of congenital hypomyelination［J］. Cell Stem Cell， 2013， 12（2）:252–264.

［14］ AASEN T， RAYA A， BARRERO M J， et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes［J］. Nat Biotechnol， 2008，26（11）:1276–1284.

［15］ PARK l H， ZHAO R， WEST J A， et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors［J］. Nature，2008， 451（7175）:141–146.

［16］ YU J， VODYANlK M A， SMUGA–OTTO K， et al. lnduced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells［J］. Science， 2007，318（5858）:1917–1920.

［17］ TOKUMOTO Y， OGAWA S， NAGAMUNE T，et al. Comparison of efficiency of terminal differentiation of oligodendrocytes from induced pluripotent stem cells versus embryonic stem cells in vitro［J］. J Biosci Bioeng， 2010， 109（6）:622–628.

［18］ OGAWA S， TOKUMOTO Y， MlYAKE J， et al. lnduction of oligodendrocyte differentiation from adult human fibroblast–derived induced pluripotent stem cells［J］. ln Vitro Cell Dev Biol Anim， 2011， 47（7）:464–469.

［19］ SONG B， SUN G， HERSZFELD D， et al. Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis［J］. Stem Cell Res， 2012， 8（2）:259–273.

［20］ PLUCHlNO S， QUATTRlNl A， BRAMBlLLA E， et al. lnjection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis［J］. Nature， 2003，422（6933）:688–694.

［21］ YANG J， YAN Y， ClRlC B， et al. Evaluation of bone marrow– and brain–derived neural stem cells in therapy of central nervous system autoimmunity［J］. Am J Pathol， 2010，177（4）:1989–2001.

［22］ CZEPlEL M， BALASUBRAMANlYAN V，SCHAAFSMA W， et al. Differentiation of induced pluripotent stem cells into functional oligodendrocytes［J］. Glia， 2011，59（6）:882–892.

［23］ POUYA A， SATARlAN L， KlANl S， et al. Human induced pluripotent stem cells differentiation into oligodendrocyte progenitors and transplantation in a rat model of optic chiasm demyelination［J］. PLoS One， 2011，6（11）:e27925.

［24］ DOUVARAS P， WANG J， ZlMMER M， et al. Efficient generation of myelinating oligodendrocytes from primary progressive multiple sclerosis patients by induced pluripotent stem cells［J］. Stem Cell Reports，2014， 3（2）:250–259.

［25］ TAMAKl S， TOKUMOTO Y. Overexpression of cyclin dependent kinase inhibitor P27/Kip1 increases oligodendrocyte differentiation from induced pluripotent stem cells［J］. ln Vitro Cell Dev Biol Anim， 2014，50（8）:778–785.

［26］ CZEPlEL M， LElCHER L， BECKER K， et al. Overexpression of polysialylated neural cell adhesion molecule improves the migration capacity of induced pluripotent stem cell–derived oligodendrocyte precursors［J］. Stem Cells Transl Med， 2014， 3（9）:1100–1109.

［27］ KlM J， EFE J A， ZHU S， et al. Direct reprogramming of mouse fibroblasts to neural progenitors［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2011， 108（19）:7838–7843.

［28］ THlER M， WORSDORFER P， LAKES Y B， et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells［J］. Cell Stem Cell， 2012， 10（4）:473–479.

［29］ RlNG K L， TONG L M， BALESTRA M E， et al. Direct reprogramming of mouse and human fibroblasts into multipotent neural stem cells with a single factor［J］. Cell Stem Cell， 2012，11（1）:100–109.

［30］ LUJAN E， CHANDA S， AHLENlUS H， et al. Direct conversion of mouse fibroblasts to self–renewing， tripotent neural precursor cells［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2012，109（7）:2527–2532.

［31］ HAN Y C， LlM Y， DUFFlELDL M D， et al. Direct reprogramming of mouse fibroblasts to neural stem cells by small molecules［J］. Stem Cells lnt， 2016:4304916.

［32］ NAJM F J， LAGER A M， ZAREMBA A，et al. Transcription factor–mediated reprogramming of fibroblasts to expandable， myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells［J］. Nat Biotechnol， 2013，31（5）:426–433.

［33］ YANG N， ZUCHERO J B， AHLENlUS H， et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion［J］. Nat Biotechnol， 2013，31（5）:434–439.

［34］ KlM J B， LEE H， ARAUZO–BRAVO M J， et al. Oct4–induced oligodendrocyte progenitor cells enhance functional recovery in spinal cord injury model［J］. EMBO J， 2015，34（23）:2971–2983.

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病，多发生于青壮年，是成人神经性致残的主要原因。传统治疗仅能延长疾病的缓解期，并不能彻底治愈。诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）具有干细胞的分化全能性，在MS细胞替代疗法中具有广阔的应用前景；而体细胞转分化技术相较于传统的iPSCs分化成少突胶质细胞谱系，缩短了时间窗，为MS治疗提供了一条新思路。随着获取神经干细胞和少突胶质细胞效率和质量的提高，未来的MS细胞治疗将有望取得重大的突破。

DOI:10.12022/jnnr.2016-0026

通信作者

管阳太

E-MAIL

yangtaiguan@sina.com

基金项目：国家自然科学基金重点项目（编号：81230027）；国家自然科学基金面上项目（编号：81471219）；上海市优秀学术带头人计划（编号：14XD1403400）

CORRESPONDING AUTHOR

Advances in treatment with induced pluripotent stem cells and somatic cell transdifferentiation for multiple sclerosis

LI Mei1， XIE Chong1， GUAN yangtai1， 2

1. Department of Neurology， Changhai Hospital， Second Military Medical University， Shanghai 200433， China；

2. Department of Neurology， Renji Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine， Shanghai 200127， China

KEy WORDS:Multiple sclerosis； Induced pluripotent stem cells； Transdifferentiation