转分化技术在神经修复中的应用

何怡果，谢乐斯，邱猛生,3,4，杨俊林,3

(1. 杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 311121； 2. 杭州市第一人民医院，浙江 杭州 310006； 3. 浙江省器官发育与再生技术研究重点实验室，浙江 杭州 311121; 4. 美国路易斯维尔大学医学院，美国肯塔基州 路易斯维尔 40292)

1962年，科学家通过对细胞核移植的研究，打破了关于成熟体细胞无法重编程的传统观点[1].其研究表明，卵子细胞质中有一些因素可以使分化成熟的细胞恢复多能性.1987年，研究者通过过表达MyoD基因成功实现了小鼠成纤维细胞到成肌细胞的转分化[2].2006年，科学家用Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4 4个基因诱导小鼠成纤维细胞发生基因组重编程，获得了诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs).iPSCs具有分化多潜能性，能够分化为3个胚层的组织细胞[3-4]，并且规避了异体干细胞移植的伦理及免疫排斥问题[5-6].然而，后续研究表明，iPSCs的应用仍然面临癌变和分化效率低下等诸多挑战.这些问题促成了转分化技术的出现.转分化是指将一种特定的体细胞直接转变为另一种细胞的技术，中间不经过多潜能干细胞状态.转分化技术有望实现病变组织的原位修复，相对于干细胞移植而言，这种治疗策略涉及到的免疫学及伦理问题更少.目前，这一技术获得了神经再生医学的青睐.肌萎缩性侧索硬化、帕金森病和阿尔茨海默病等中枢神经系统疾病通常伴随着神经元的逐渐丧失和退化[7-8].多发性硬化和脑白质营养不良等疾病，则往往由少突胶质细胞(oligodendrocytes，OLs)凋亡引起脱髓鞘所导致.在上述神经疾病中，除了发生神经元或少突胶质细胞凋亡以外，星形胶质细胞还会因受到刺激而被活化[9-11]，分泌神经抑制因子阻止神经元的生长[11].转分化技术的出现为神经修复治疗带来了新的曙光，可以通过将病灶附近的冗余细胞如星形胶质细胞或炎症细胞等转分化为功能性的神经元(induced Neuron, iNeuron)或少突胶质细胞(induced Oligodendrocyte, iOL)，从而促进神经环路重建或髓鞘再生.文章系统地综述了转分化技术在神经修复领域的研究进展.

1 神经修复的转分化技术基础

1.1 转录因子诱导转分化

转录因子诱导的转分化是目前使用最广泛、最主要的诱导方法.人们通过转录因子组合和关键转录因子过表达等方式，已经成功地转化了多种近缘和远缘细胞.Shinya Yamanaka在2006年的重要报道激发了人们对远缘细胞之间实现直接转分化的思考.在神经细胞领域，研究者们在大脑皮层星形胶质细胞中发现，Pax 6的过表达可以将星形胶质细胞转分化为神经元[12].同样，一些研究也证明，星形胶质细胞可以通过过表达Ascl1或Ngn2转分化为神经元[13].之后，肝细胞、周细胞[14]和成纤维细胞[15]等向神经元的转分化也被证明.其中，成纤维细胞因为其数量多、分布广等优势，常作为科学家们研究转分化的材料.再之后，人们也实现了小鼠成纤维细胞向神经细胞的转分化[16].Zhang等证明反应性神经胶质细胞可通过单一神经转录因子NeuroD1的过表达而重编程为功能性神经元[17].科学家通过NeuroD1与BAM的组合成功地从人成纤维细胞产生功能性运动神经元.形态学和功能鉴定进一步表明NeuroD1和BAM的结合产生了最成熟的神经元细胞[18].血清素能神经元是中脑中相对较少的一类神经元，在大脑中发挥多种重要功能.血清素能神经元的功能障碍将导致包括焦虑、孤独症、抑郁症和饮食障碍等多种精神疾病.最近研究显示，通过过表达Ascl1、Foxa2、Lmx1b和FEV 4种转录因子，人原代成纤维细胞可以直接转分化为血清素能神经元[19].这些诱导的血清素能神经元能够表达成熟血清素能神经元的特异性标志物.

多发性硬化和脑白质营养不良等脱髓鞘疾病的治疗需要功能性少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cell，OPC).然而实验证明OPC并不容易获得，从人类多能干细胞的定向分化中获得可移植的OPC很困难.多年前，Najm等使用几组转录因子将小鼠胚胎和肺成纤维细胞直接转化成诱导性少突胶质细胞前体细胞(induced oligodendrocyte precursor cell，iOPC)[20].近年，Yang等通过过表达Sox10、Olig2和ZFP536 3种转录因子将小鼠和大鼠成纤维细胞直接转分化为iOPCs[21].星形胶质细胞是中枢神经系统中最丰富的细胞类型，是维持大脑稳态的重要神经细胞，其功能障碍会导致如肌萎缩性侧索硬化、阿尔茨海默氏病等多种神经疾病.2015年，Caiazzo等利用NFIA、NFIB和Sox9将小鼠成纤维细胞高效地转分化为星形胶质细胞.

1.2 microRNA诱导转分化

microRNA是靶mRNA的阻遏物，参与基因表达的转录后调控，在直接重编程中发挥着重要作用[22-23].2011年，研究者发现miR-124与两种转录因子Brn2和Myt1L一起，可以诱导成年人皮肤成纤维细胞快速转分化为功能性神经元[24]，诱导获得的神经元之间能够产生功能性突触.之后，科学家使用了两种在大脑中高度表达的miR-9/9*和miR-124，成功地将人成纤维细胞转化为有生理功能的神经元[25].然而，仅用microRNAs获得的MAP2阳性细胞的百分比相当低.为了提高神经元的转化效率和成熟程度，microRNAs需要与额外的转录因子如D2、Asc1和Myt1L配合使用.尽管microRNA有不整合、易转染、更安全等优点，但是其诱导的转分化效率非常低，很少有人单独使用，因此microRNA在转分化上的应用尚需更多探究.关于microRNA诱导产生神经元的报道已不罕见，但诱导产生少突胶质细胞的报道则较少.

1.3 小分子化合物诱导转分化

上述方法中都涉及到基因操纵，所以难以避免临床应用的安全性问题.因此，有必要寻求一种具有低免疫原性、低成本和易于操作的替代策略.相比之下，小分子策略避免了基因操纵带来的众多风险，可能是最有希望的潜在解决方案之一.早期研究发现，化学物质可以通过提高转分化效率来影响体细胞向体细胞或体细胞向iPSC转变的进程[26-27]，只使用小分子化合物不太可能完成体细胞之间的转分化.之后的研究表明，化学物质能够诱导体细胞的转分化.2013年，有研究者利用7个小分子化合物组合成功将小鼠胚胎成纤维细胞直接诱导为多能干细胞[28].之后，科学家也利用小分子化合物成功将小鼠成纤维细胞转分化为了功能性神经细胞[29].同样，Zhang等证明，将人星形胶质细胞连续置于9种小分子的混合物中，可以在8～10 d内成功地将其转分化为神经元[17].总的来说，通过小分子驱动的直接转分化来产生神经细胞具有很大的临床应用潜力.但是由于小分子化合物的多样性和复杂性，其使用难度较高.

1.4 其他诱导方法转分化

除上述转分化方法之外，人们还发现了其他一些诱导转分化的方法.但是由于这些方法本身的缺陷或对其研究不够等原因，未能大量或者广泛使用.人们利用细胞因子组合完成了多能干细胞的定向分化，也利用细胞因子的调整成功实现了成体干细胞的体外转分化.如科学家经过VEGF处理，成功在体内将骨髓间充质干细胞转化成内皮细胞，在体外也利用细胞因子组合使其成功转分化为神经细胞等[30].但是，由于诱导转分化时细胞因子的利用难度较大，获得的成体细胞与原代细胞有较大的功能差距等原因，通常只作为其他诱导分化方法的辅助手段.

另外，对表观遗传修饰起调控作用的蛋白也被发现含有诱导细胞转分化的作用.组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化、DNA甲基化等表观遗传修饰在体细胞转分化为多能干细胞的过程中发挥重要作用.如在诱导多能干细胞的过程中，DNA甲基化和小分子抑制剂抑制组蛋白乙酰化可以起到促进作用[31-32].不过目前科学家对表观遗传调控机制在转分化过程的作用了解较少，转分化的方向依然由转录因子等决定，表观遗传修饰主要起辅助作用.

2 转分化技术的神经修复策略

神经细胞与身体正常生理活动密切相关，神经细胞的退化或损伤将会导致对应神经疾病的发生.通过转分化技术将其他细胞诱导分化为目标神经细胞，从而实现神经修复，已成为值得探索的新治疗方向.

2.1 外源细胞转分化移植修复策略

2.1.1 转分化为神经胶质细胞的移植修复

髓鞘丧失或功能障碍影响到全世界数百万人.OPC是中枢神经系统中少突胶质细胞的主要来源，在髓鞘疾病动物模型中用于细胞治疗展现出广阔前景.2013年，Najm等使用3组特定转录因子将小鼠胚胎和肺成纤维细胞直接转分化为iOPCs[20]，这些iOPCs显示出与原代OPCs一致的双极形态和基因表达谱，可以在体外扩增至少5代，同时保持着分化为少突胶质细胞的能力.当移植到脱髓鞘小鼠中时，它们能覆盖宿主轴突并产生致密的髓鞘，展现了修复髓鞘的潜力.同年，Yang等通过过表达3种转录因子(Sox10、Olig2和Zfp536)将小鼠和大鼠成纤维细胞重编程为与原代OPCs非常相似的iOPCs[33]，这些iOPCs在体外能够增殖并且具有分化为少突胶质细胞的潜能，在移植到髓鞘发育不良的患病小鼠大脑后参与了髓鞘形成.

2.1.2 转分化为神经元的移植修复

Zhang等将人星形胶质细胞转分化为神经元以后，注射到小鼠大脑中，这些人神经元可以在小鼠脑内存活超过1个月，并整合到神经回路中[17].这为神经再生修复提供了新思路.中脑多巴胺能神经元的功能和结构异常与帕金森病等多种神经退行性疾病有着密切关系.因此，人们在体细胞向多巴胺能神经元的转化上进行了努力尝试.2011年，科学家通过BAM、Foxa2和Lmx1A同时过表达，成功将人类胚胎成纤维细胞转分化为中脑多巴胺能神经元[34].无独有偶，另一种转录因子Ascl1和中脑多巴胺能神经元特异性转录因子Nurr1和Lmx1A一起也能有效地将小鼠或人成纤维细胞转分化成多巴胺能神经元[35].但由于它们与内源性多巴胺神经元相比不太成熟，并且缺乏亚型特异性标志物的表达，这些诱导获得的多巴胺能神经元不能完全替代成熟的多巴胺能神经元.不过，将这些诱导性多巴胺能神经元移植到帕金森病小鼠纹状体中后，帕金森病的症状得到了显著缓解.脊髓运动神经元在中枢神经系统损伤和退行性疾病中也扮演着重要角色.2011年，科学家利用4种转录因子Lhx3、Hb9、Isl1和Ngn2成功将小鼠成纤维细胞转分化为功能性运动神经元(induced motoneuron，iMN)[36].他们将iMNs移植到鸡胚的神经管中，结果显示iMNs能够植入、迁移到合适的整合位点，并在体内正确响应引导信号，不仅表达泛神经元和运动神经元特异性标记，而且还获得了激发动作电位和接收突触输入的能力，表明其应用于移植再生的潜力.

2.1.3 转分化为神经前体细胞的移植修复

神经前体细胞(neural precursor cell,NPC)具有分化为所有类型神经细胞的能力，而且能够参与中枢神经系统的损伤修复，利用NPC修复脑和脊髓的损伤具有很好的应用前景.2011年，Lujan等成功实现利用转录因子将小鼠胚胎成纤维细胞诱导为诱导神经前体细胞(induced neural precursor cell,iNPC)，这些iNPCs不仅可以分化为神经元和星形胶质细胞，还可以分化为少突胶质细胞.移植实验表明iNPCs在脑内能够分化为少突胶质细胞，与内源性神经前体细胞分化而来的少突胶质细胞一样具有形成髓鞘的能力.他们的实验证明了iNPCs自体移植用于神经再生修复的可能.

2.2 内源细胞原位转分化修复策略

尽管将其他成体细胞转分化为神经细胞具有很大的应用潜力，但这一策略仍然面临细胞移植对神经系统可能造成的损伤.因此，将内源体细胞转分化为目标神经细胞的原位修复策略引起了研究者们的极大兴趣.

2.2.1 星形胶质细胞原位转分化修复

人们发现，原位内源细胞可以通过重编程方法产生目标细胞.从这个角度来看，中枢神经系统内星形胶质细胞可能比其他细胞类型更具优势.星形胶质细胞是哺乳动物中枢神经系统中最丰富的细胞，不仅在生理活动中起着不可或缺的作用[37]，而且还参与很多神经疾病的病理过程[10].一旦中枢神经系统受到损伤，星形胶质细胞就会受刺激而被活化，不断增殖而形成胶质瘢痕.如果这些活化的星形胶质细胞能够被重编程为功能性神经元或少突胶质细胞，神经修复的过程将会大大缩短，胶质疤痕也很可能会逐渐减少甚至消去.因此，星形胶质细胞原位转分化引起了众多研究者的关注.2002年，一项体外研究表明，星形胶质细胞可以通过Pax6的过表达而重编程为诱导性神经元.之后，Torper等在小鼠体内实现了星形胶质细胞到神经元的转分化，这些转分化而来的神经元在GFAP-Cre转基因小鼠模型纹状体中表现稳定，并整合到神经网络中[38].2016年，研究者发现Sox2基因可以基于PBAE的纳米粒子传递到原代人星形胶质细胞中，并将其转分化为神经元[39].纳米粒子介导的转基因规避了病毒载体的潜在风险，用于转染原代人星形胶质细胞的PBAE载体基因表达效率高，细胞毒性较低，被视作潜在的临床应用候选载体.在刺伤部位的活化星形胶质细胞中过表达神经元转录因子NeuroD1，可以将它们转分化为功能性神经元[40].这些神经元具备重复动作电位和自发突触反应，并进一步与周围神经元形成功能连接.而且，这些神经元在成年小鼠皮层中可以存活2个多月，表现出了它们在大脑修复治疗上的巨大潜力.研究者直接将NeuroD1逆转录病毒注射到阿尔茨海默病小鼠模型的皮质中，能够诱导胶质细胞转分化为功能性神经元.因此，星形胶质细胞向神经元的转化为创伤性神经损伤和神经疾病的自体修复提供了重要方案.

2.2.2 对NG2+细胞原位转分化修复

NG2+细胞存在于中枢神经系统，是一类细胞亚群，能够产生少突胶质细胞、原浆性星形胶质细胞和神经元等.2013年，Guo等证明，阿尔茨海默病模型或损伤小鼠皮层中的NG2+细胞可以通过过表达NeuroD1而在体内直接转分化为功能性神经元[40].NeuroD1表达后，星形胶质细胞被重编程为谷氨酸能神经元，而NG2+细胞被转分化为谷氨酸能和γ-氨基丁酸能神经元，这些神经元最终整合到了局部神经回路中.2015年，Torper等提出了一种基于腺相关病毒(AAV)的转化系统，可用于特异性高效转化胶质细胞，并且允许对新神经元的表型和功能进行长期分析[41].将病毒载体注射到小鼠纹状体中后，纹状体NG2+细胞可以转化为γ-氨基丁酸能和谷氨酸能神经元，这些神经元长期保持稳定，显示出功能神经元的电生理特性，并且以有效的方式整合到局部神经回路中，他们的研究成果为神经修复开辟了一条新的治疗途径.

2.2.3 神经元原位转分化修复

由于不同的神经元在形态特征、神经递质的释放、长距离轴突延伸等方面各有不同，神经元到神经元的转分化可能更容易产生高度特异性的神经元.这种策略不仅使新产生的神经元易于整合到神经回路中，大大降低形成肿瘤的风险，同时可以维持神经元的基本性质和功能.所以，对于临床应用来说，这种转化更加方便、安全，是一种理想的神经元修复策略.研究表明神经元之间的转分化是可以实现的[42].2013年，科学家发现单独过表达Fezf2可以直接将早期胼胝体投射神经元转分化为皮质激素神经元[43]，这就证明了早期神经元的转分化是可行的.但之后的研究发现，当神经元逐渐老化时，神经元的直接转化变得越来越困难[44].因此，为了实现神经元转分化直接得到成熟神经元或者实现对成熟神经元的直接转分化，科学家接下来需要对成熟神经元转分化机制进行研究.

3 评价与展望

从转分化技术的发展方面来看，转分化技术由于简单，而且能够直接以患者自体细胞转分化为目标功能细胞，有规避伦理、免疫排斥和肿瘤形成等问题的众多优点，在细胞治疗上展现出广阔的应用前景.但从目前的情况来看，转分化技术的应用尚面临挑战.第一，转分化过程中主要通过基因操作实现，而基因操作存在着致癌风险.所以科学家开发了小分子化合物诱导转分化以避免基因操作.然而，仅少数细胞在小分子化合物的诱导下实现了转分化.小分子化合物的更广泛应用可以进一步推动转分化技术的发展.第二，转分化获得的目标细胞数量较少.转分化技术直接将成体细胞进行转化，而成体细胞通常不能或难以增殖.如何获得足够数量的目标细胞以进行更深层的探究，也是一个有待突破的难题.

转分化技术在神经系统再生修复领域尚有许多难题有待攻克.首先，发育成熟是神经细胞发挥生理功能的关键因素之一，通过转分化获得神经元或者少突胶质细胞要解决好诱导难度和成熟度的矛盾，即越年轻的细胞越容易发生转化，而越年轻的神经细胞功能性越差.其次，转分化的效率有待提高.当前已经实现的神经细胞转分化实验中，都遇到了转分化效率低的问题.为了更深层次的探究和临床的应用，研究者需要在提高转分化效率上做更多探究.最后，在基础研究达到一定的突破后，如何建立一个稳定、高效的临床应用诱导系统成为转分化技术能否实现对患者的临床治疗的关键问题.