金创抗菌膏对糖尿病难愈性皮肤溃疡中Ⅰ、Ⅲ胶原及MMP-13表达的影响*

殷 菱，唐 莉，石镁虹，刘珉甬，任晓军，程基焱

（西南医科大学：1医学基础研究中心；2附属医院分子医学实验中心；3护理器械研发实验室，四川泸州 646000）

金创抗菌膏对糖尿病难愈性皮肤溃疡中Ⅰ、Ⅲ胶原及MMP-13表达的影响*

殷 菱1，唐 莉2，石镁虹2，刘珉甬3，任晓军1，程基焱1

（西南医科大学：1医学基础研究中心；2附属医院分子医学实验中心；3护理器械研发实验室，四川泸州 646000）

目的：探讨金创抗菌膏对治疗糖尿病难愈性皮肤溃疡Ⅰ、Ⅲ胶原及MMP-13表达的影响。方法：32只糖尿病大鼠模型造模成功的雄性SD大鼠随机分为生理盐水组和金创抗菌膏治疗组（每组 16只），另外选择 16只健康雄性SD大鼠作为对照组，三组大鼠同时制作创面模型。创面造模成功后，每天每组分别换药，于第 7 d、14 d，每组处死8只大鼠。HE染色观察压疮皮肤形态改变；免疫组织化学技术检测基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）的表达变化，RT-PCR技术检测MMP-13 mRNA的表达；苦味酸-天狼星红染色观察Ⅰ、Ⅲ型胶原面积变化。结果：HE染色显示金创膏组较生理盐水组更早出现肉芽组织，且成纤维细胞排列规则呈“指纹状”；对照组成纤维细胞极性消失及胶原纤维排列紊乱，肉芽组织出现较晚。免疫组化及RT-PCR显示，金创抗菌膏治疗组MMP-13表达比对照组和生理盐水组均降低（P＜0.05）。苦味酸-天狼星红染色显示与其它两组比较，金创抗菌膏组Ⅲ胶原面积最大，Ⅰ型胶原面积最小。结论：金创抗菌膏可以促进大鼠糖尿病皮肤溃疡的愈合，可能与调控创面皮肤Ⅰ、Ⅲ胶原基因及MMP-13的表达相关。

金创抗菌膏；糖尿病溃疡；Ⅰ、Ⅲ胶原；基质金属蛋白酶13

糖尿病 （diabetes mellitus，DM）患者并发溃疡后，由于创面愈合紊乱，缺血病变、神经病变、局部感染等多因素使细胞增殖分化能力减弱，创面愈合比非糖尿病患者更难。目前，中西医治疗均具有一定的局限，如何更有效的治疗DM难愈性溃疡对减轻患者痛苦、改善预后有极大的临床意义。金创抗菌膏由多种中药精制而成，具有清热解毒消肿、活血化瘀止痛、去腐生肌敛疮等作用特点，对一些皮肤难愈性溃疡有良好的治疗效果[1-2]，但其分子机制不明。为探讨金创抗菌膏对DM难愈性皮肤溃疡的疗效及其对Ⅰ、Ⅲ胶原及基质金属蛋白酶13（matrix metallproteinase 13，MMP-13）表达的影响，特做如下研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

健康SD雄性大鼠，二级、清洁，体重220~260 g（重庆腾鑫生物技术有限公司提供）。

1.1.2 主要试剂

链脲佐菌素购自上海信然生物科技有限公司；金创抗菌膏购自泸州天泰生物科技开发有限公司提供；兔抗鼠MMP-13多克隆抗体、SABC免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。RNA抽提试剂、反转录试剂、PCR试剂盒均购自TaKaRa公司。

1.2 动物模型的建立

1.2.1 糖尿病大鼠模型

方法[3]，结合实际，按如下步骤完成造模。造模大鼠在空腹3 h状态下，称重。按 35 mg/kg尾静脉注射 1% 链脲佐菌素 （STZ）溶液 （用 0.1 mmo1/L枸橼酸钠缓冲液配制）。 7 d后测血糖，随机血糖超过 11.1 mmol/L的大鼠，继续喂养 4月。4月后，造模大鼠随机血糖大于 11.1 mmol/L者视为糖尿病大鼠模型成功。

选择糖尿病模型造模成功的大鼠 32只，随机分为金创抗菌膏组，生理盐水组，每组16只。另取16只正常状态大鼠作为对照组。

1.2.2 皮肤溃疡模型

2%戊巴比妥钠腹腔麻醉，8%硫化钠脱毛。常规消毒，于大鼠背部脊柱附近腰背部两侧，标记出直径为2.0 cm的圆形图案，用手术剪沿着标记范围剪去全层皮肤和皮下结缔组织，深至筋膜，造成缺损创面，保证初始创面面积大小一致.。止血后以无菌纱布包扎固定。次日起，每日用50%冰醋酸涂抹创面一次，1周后形成皮肤溃疡大鼠模型。溃疡形成后，每天分组换药，金创抗菌膏组用金创抗菌膏换药，生理盐水组用生理盐水冲洗后包扎处理，对照组让其自然愈合。在造模后第7 d、14 d各处死8只大鼠，取创面与正常皮肤交界处组织，进行相关实验。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 形态学检测

标本以4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片。HE染色、免疫组化染色。具体步骤参考前期文献[2]。采用日本OLYMPUS公司的BX-53显微成像系统进行观察分析及照相。每张切片自表皮向真皮深层随机抽取8个视野照相。利用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统，测定平均光密度值 （average optical density，AOD）。

1.3.2 苦味酸-天狼星红染色

将制作好的组织切片放入二甲苯 （10 min）→100%酒精（5 min）→100%酒精（5 min）→95%酒精（5 min）→90%酒精（5 min）→85%酒精（3 min）→75%酒精（3 min）→蒸馏水（2 min）→天青石蓝液→蒸馏水洗3 min×3次→天狼星红饱和苦味酸液 （30 min）→蒸馏水洗3 min×3→75%乙醇（30 s）→85%乙醇（30 s）→95%乙醇（5 min）→95%乙醇（5 min）→无水乙醇（10 min）→干燥后入二甲苯（5 min）→中性树胶封片、偏振光显微镜下观察，照相。

1.3.3 RT-PCR检测MMP-13 mRNA水平

根据Tri Reagent说明书提取各组组织总RNA，测A260/A280在1.8~2.0之间。2步法RT-PCR检测mRNA，以GAPDH为内参。具体序列见表1。反应条件：94℃ 变性3 min，94℃ 30 s，58℃ 退火30 s，72℃30 s，72℃ 延伸5 min，共35个循环。PCR扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳后，采用凝胶成像分析系统照相并分析其吸光度值。以目的基因与内参的比值进行统计分析。

1.4 统计分析

应用SPSS 17.0软件进行统计分析，所有计量资料以±s表示，多个样本均数比较单因素方差分析 （one-way ANOVA），组间两两比较采用LSD比较，两个样本均数比较采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

表1 基因引物序列

2 结果

2.1 大鼠皮肤溃疡HE染色结果

7 d时，与对照组相比，真皮层底部成纤维细胞数量，生理盐水组较少，而金创抗菌膏组较多；胶原纤维的排列上，生理盐水组胶原粗大，排列紊乱，金创抗菌膏组胶原纤维较细且排列整齐；炎细胞聚集上，生理盐水组真皮层有大量炎性细胞聚集，而金创抗菌膏组真皮层较少炎性细胞浸润。14 d时，与7 d时相比，生理盐水组真皮层聚集成纤维细胞数量增加，形状多不规则，细胞排列无极性，分泌胶原排列紊乱，团块状，再生复层扁平上皮细胞不明显，较多炎性细胞；金创抗菌膏组真皮层成纤维细胞减少，多为长梭形，排列整齐，胶原排列整齐，再生的复层扁平上皮细胞排列整齐，炎细胞较少，见图1。

图1 HE染色显示大鼠溃疡组织7 d、14 d结构（×400）

2.2 苦味酸-天狼星红染色结果

在偏振光显微镜下，Ⅰ型胶原纤维具有强双折光性，排列紧密，镜下呈现红色，Ⅲ型胶原纤维具有弱折光性，镜下呈绿色。7 d时，生理盐水组，镜下可见Ⅰ型胶原纤维较其它两组多，纤维粗，排列紧密紊乱，面积较Ⅲ型胶原纤维多。金创膏组，镜下可见Ⅲ型胶原纤维较多，绿色纤维较细排列呈网状，面积多于红色Ⅰ胶原纤维。14 d时，生理盐水组，镜下可见，红色Ⅰ型胶原纤维较1周前增多，纤维粗，排列紧密紊乱，面积较Ⅲ型胶原纤维多。金创膏组，镜下Ⅲ型胶原纤维较一周前增多，纤维较细，排列呈疏松的网状，排列整齐，面积明显多于红色Ⅰ型胶原纤维。对照组的表现介于金创抗菌膏组和生理盐水组之间，见图2。

2.3 MMP-13免疫组织化学染色结果溃疡组织染色阳性区域呈现棕黄色，切片观察MMP-13阳性表达接近溃疡组织真皮乳头层和表皮基底层时最强，真皮乳头层向下逐渐减弱，成纤维细胞细胞质和细胞外基质中均有表达，正常组织几乎不表达。7 d、14 d时，金创抗菌膏组MMP-13表达最弱（P＜0.05）。各组第14 d与第7 d时MMP-13平均光密度值比较，不同程度减弱，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3、表2。

2.4 MMP-13 mRNA结果

与对照组及生理盐水组相比，金创抗菌膏能够降低组织内MMP-13 mRNA的表达；与生理盐水组相比，对照组MMP-13 mRNA表达也降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。但各组14 d与7 d相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4，表3。

图2 苦味酸-天狼星红染色显示大鼠溃疡组织7 d、14 d时Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维表达（×400）

图3 免疫组化染色显示大鼠溃疡组织7 d、14 d时MMP-13表达（×400）

表2 7 d、14 d时MMP-13的平均光密度值（±s，n=8）

表2 7 d、14 d时MMP-13的平均光密度值（±s，n=8）

注：a与对照组比，P＜0.05；b与生理盐水组比，P＜0.05

0 . 3 1 2 5 ± 0 . 0 0 8 6 0 . 3 2 0 4 ± 0 . 0 1 0 6a0 . 2 9 4 8 0 . 0 1 2 7ab对照组生理盐水组金创抗菌膏组0 . 3 2 8 2 ± 0 . 0 0 5 3 0 . 3 3 2 6 ± 0 . 0 1 0 4a0 . 3 1 3 3 ± 0 . 0 0 6 8ab

图4 RT-PCR示大鼠溃疡组织7 d、14 d时MMP-13 mRNA电泳图

表3 大鼠溃疡组织7d、14d时MMP-13mRNA表达（±s，n=3）

表3 大鼠溃疡组织7d、14d时MMP-13mRNA表达（±s，n=3）

注：a与对照组比，P＜0.05；b与生理盐水组比，P＜0.05;各组14 d与7 d比，P＞0.05

14 d 0.92±0.56 1.03±0.07a0.81±0.08ab组别对照组生理盐水组金创抗菌膏组7 d 0.96±0.24 1.24±0.19a0.83±0.29ab

3 讨论

糖尿病溃疡是糖尿病患者常见并发症，常因反复发作、迁延不愈而给患者带来极大压力和痛苦。因此，寻找一种有效的治疗方法是临床急需解决的重大问题之一。近年来，越来越多的研究表明，中医药对糖尿病皮肤溃疡具有显著疗效[4-6]。金创抗菌膏是根据中医药 “抗菌消炎、活血化瘀、祛腐生肌”的原理研发的纯中药制剂[2]，使用简便，临床疗效显著，但其治疗机制不明。本实验发现，金创抗菌膏治疗糖尿病皮肤溃疡时，创面炎症细胞浸润少；胶原排列整齐，且以Ⅲ型胶原为主；成纤维细胞在创面形成初期显著增多，而后期数量减少；再生复层扁平上皮细胞整齐，上皮完整。

成纤维细胞是皮肤创伤愈合过程中重要的效应细胞，机体在受到创伤刺激后，在生长因子、炎性产物等诱导下，由纤维母细胞分化而来。成纤维细胞可分泌各型胶原纤维、蛋白聚糖、糖蛋白等大分子构成细胞外基质（extracellular matrix，ECM），其中Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维在ECM的重塑中具重要作用。正常皮肤组织中以Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维为主，创伤修复中肉芽组织的Ⅲ型胶原的含量明显高于Ⅰ型胶原，在该过程中，伴随着旧胶原的降解和新胶原的产生，重新排列沉积。另有研究表明，在胚胎皮肤成纤维细胞中，以Ⅲ型胶原为主，并与胚胎无瘢痕愈合的特征相关[7]，本次试验中，苦味酸-天狼星红染色结果显示，7 d和14 d时金创膏组的Ⅲ型胶原面积明显大于Ⅰ型胶原面积，而其余两组Ⅰ型胶原面积明显大于Ⅲ型胶原面积，提示金创抗菌膏可促进Ⅲ胶原的表达而减少瘢痕的形成，从而调节DM难愈性溃疡的愈合。

MMP-13是Gross J和Lapiere CM首先发现的一种胶原水解酶[8]，在体内以前体或酶原形式分泌，被激活后发挥降解细胞外基质的作用，MMP-13的作用底物主要是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原纤维[9]，Ⅱ型胶原主要存在于软骨组织中，因此推测在皮肤溃疡愈合过程中，MMP-13对Ⅰ、Ⅲ型胶原的最终表达起到了关键性作用。有研究表明，早期溃疡组织中MMP-13的活性增高，溶解坏死组织和细菌产物，达到清创的作用。在溃疡创面肉芽组织生长阶段，创面MMP-13又降低到一个低水平，有利于创面新生Ⅰ、Ⅲ型胶原的生成、沉积和正常ECM的构建。这可能是由于在创伤的初期，由于创伤刺激，MMP-13转录和无活性的前体酶被激活，MMP-13表达量增加[10]，晚期MMP-13的活性受到抑制，胶原降解减少，沉积增加，而促进创面的瘢痕愈合。本次实验发现，随着溃疡愈合，MMP-13在每个组别中都不同程度降低，与前述文献报道一致；而金创抗菌膏组表达最弱，说明金创抗菌膏能够部分抑制MMP-13的表达利于胶原沉积，促进创面愈合。

创面愈合是一个多因素参与的复杂过程，相关分子和细胞之间彼此影响、制约、协调。而糖尿病溃疡的形成和发展不仅与免疫、代谢、神经、血管等内因相关，还与感染、压力、护理等外因相关。临床上单一的抗生素治疗和单体中药治疗疗效不太理想。金创抗菌膏是一种复方制剂，可从多方面调节糖尿病溃疡的愈合，本实验发现金创膏在治疗糖尿病难愈性溃疡时，可影响MMP-13的活化，调控Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维的表达及二者分布比例，而促进溃疡的愈合和创面的重建。

参考文献

1.程文慧，郭辉梦，李沛金，等.纯中药金创抗菌膏治疗艾滋病皮肤溃疡2例效果观察[J].中国艾滋病性病，2012，18（6）:400-401.

2.殷菱，阳艾玲，王勇，等.金创抗菌膏对大鼠压疮皮肤CTGF表达的影响及疗效观察[J].现代预防医学，2013, 40（21）:4024-4027，4034.

3.邵俊伟，蔡逊.高脂饮食联合链脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型的研究进展[J].中国实验动物学报，2014，22（4）:90-93.

4.肖青青，王一飞，李欣，等.中医药治疗糖尿病溃疡近况[J].中医学报，2015，30（1）:35-37.

5.周观彦，张伟开.中医和西医治疗糖尿病足疗效的初步比较[J].微循环学杂志，2015，25（1）:34-36.

6.赵谏，王连洁，孟艳娇，等.清热解毒箍围法促进糖尿病大鼠感染性溃疡愈合的实验研究[J].现代中医临床，2015，22（1）:44-48.

7.冯国平，孙广慈，管正玉，等.胎兔伤口无瘢痕愈合的形态学和胶原构成基础[J].中华整形外科杂志，2001，17（4）:239-241.

8.Gross J，Lapiere CM.Collagenolytic activity in amphibian tissues:a tissue assay[J].Proc Natl Acad Sci USA，1962，15（48）:1014-1022.

9.杨恒，潘伦弘，丁一.基质金属蛋白酶-13的研究进展[J].国际口腔医学杂志，2009，36（5）:561-563.

10.Brinckerhoff CE，Matrisian LM.Matrix metalloproteinases: a tail of a frog that became a prince[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2002，3（3）:207-214.

（2016-02-20收稿）

Therapeutic effect of antiseptic ointment on the expression of Col-Ⅰ，Col-Ⅲand MMP-13 on diabetic ulcer in a rat model

Yin Ling1，Tang Li2，Shi Meihong2，Liu Minyong3，Ren Xiaojun1， Cheng Jiyan1

1Research Center for Preclinical Medicine；2Experimental Center of molecular medicine，the Affiliated Hospital；3Nursing instrument research and development laboratory of Southwest Medical University；Luzhou of Southwest Medical University，Sichuan Province 646000，China

Objective:To investigate the curative effects of antiseptic ointment in a rat model on diabetic ulcer and to explore its potential mechanism.Methods:32 rats，after establishing the model of diabetic ulcer，were divided into 2 groups randomly:physiological saline group and antiseptic ointment treatment group，and 16 healthy rats were used as a control group.The changes of the morphological structure was examined by HE staining;the expression of MMP-13 was determined by immunohistochemical staining;the mRNA expression of MMP-13 was assessed by RT-PCR;and the area of collagenⅠand collagenⅢ were measured by picric acid-Sirius red staining.Results:Compared with control group，mRNA and protein expression of MMP-13 were decreased remarkably in antiseptic ointment treatment group（P＜0.05），and the area of collagenⅢ was increased.Conclusion:The expression of typeⅠandⅢ collagens and matrix metalloproteinase 13 can be modulated by antiseptic ointment in a rat model of diabetic skin ulcer.

Antiseptic ointment;Diabetic ulcer;CollagenⅠ/Ⅲ;Matrix metalloproteinase 13

R242

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.03.012

*四川省卫生厅科研项目（130267），泸州市科技局科研项目（2012-177）

殷 菱（1979-），女，硕士，讲师。

程基焱（1971-），男，硕士，教授。E-mail:49046804@qq.com