罗汉果柱头可授性及花粉活力测定研究

郭丽霞　蓝福生　张燕玲　潘利清

摘要：【目的】找出罗汉果柱头可授性的变化规律，延长罗汉果授粉时间和增加授粉机会，提高罗汉果授粉成功率。【方法】采用染色法、萌发法测定花粉活力及柱头可授性。【结论】罗汉果人工喷雾授粉前，确定花粉活力及柱头可授性，可提高喷雾授粉成功几率；花粉离体萌发法、MTT（噻唑蓝）染色法分别为罗汉果花粉活力及柱头活力测定的最适合方法。

关键词：罗汉果；柱头可授性；花粉活力

中图分类号：S668.9 文献标识码：A 文章编号：1003-4374（2015）06-012-04

Abstract：Pollen viability and stigma receptivity were identified before artificial pollination using pollen suspension spray of momordica grosvenor. We applied staining technique and germination in vitro for vitality test.The study found that the pollen grain viability was measured by germination rates using liquid medium. And the best method of stigma receptivity was measured by dyeing rate by MTT.

Keyword：momordica Grosvenor；stigma receptivity；Pollen viability

罗汉果为雌雄异花授粉植物，需人工授粉才能获得产量。在人工喷雾授粉之前，花粉质量的好坏，不仅影响喷雾授粉的成功，也影响果实的品质，所以有必要研究确定罗汉果花粉活力范围及其保存技术。田间授粉成功率的高低，与花粉活力、柱头状态、营养状态等植株自身条件有关，还与田间天气条件（湿润、干燥、大风、高温等）条件有关。为找出罗汉果柱头可授性的变化规律，延长罗汉果授粉时间和增加授粉机会，提高罗汉果授粉成功率，进行本试验。

1 材料与方法

1.1 品种来源

罗汉果品种来源为桂林市大地生物技术有限公司提供的“大地二号”植株。

1.2 试验时间和地点

试验地为桂林吉福思罗汉果有限公司实验室及种植基地，试验时间为2012年至-2014年6-8月罗汉果开花期。

1.3 试验方法

1.3.1 柱头可授性测定

（1）联苯胺过氧化氢法。将联苯胺、过氧化氢、水按体积比制成混合液，1%联苯胺：3%过氧化氢：水=4：11：22（体积比）配好[1]。将采集的柱头浸没在联苯胺过氧化氢液内。若柱头具有可授性（呈现出过氧化物酶活性），则降解过氧化氢，柱头表面变成蓝黑色并有大量气泡产生，根据气泡数的多少确定其柱头可授性的强弱。

（2）MTT（噻唑蓝）染色法。称取0.1g MTT，溶解于5ml配制好的50g/L蔗糖溶液中，摇匀置于冰箱中避光保存。配制好的溶液呈鲜黄色。将柱头浸没在MTT溶液中，2-15min后观察柱头的颜色变化[2]。若柱头呈深紫黑色甚至黑色，表示柱头有活力，具有可授性；若柱头浅蓝色或柱头变色不明显，则柱头活力差，不具有可授性。

1.3.2 花粉活力测定 采摘当天清晨开放的新鲜雄花1朵。用以下三种方法分别测定同一朵雄花花粉的活力。

（1）醋酸洋红染色法。预先配制好醋酸洋红染色液，在凹玻片上滴一滴醋酸洋红染色液，将花粉轻轻刮入染色液，搅匀，在显微镜下观察花粉粒颜色变化。

（2）TTC染色法。预先配制好TTC染色液。取少量花粉置于凹玻片上，滴入TTC溶液，用镊子搅拌均匀，在25-28℃的温度下放置15-20min后在显微镜下观察。

（3）离体萌发法。按15%蔗糖+ 0.2g/L硼酸+ 0.05g/L硝酸钙 + 0.2g/L CMC配制培养液，搅拌溶解后倒入试剂瓶内备用。

将配制好的培养液滴一滴在凹玻片凹槽内，用镊子挑取适量花粉混匀，置于有湿润滤纸或棉花团的培养皿内，盖上盖子，保持在27℃的室温内。30-40min后，在显微镜下观察花粉萌发情况。以花粉管长度超过花粉粒直径为萌发花粉，统计萌发花粉粒和视野内总花粉粒数，计算花粉萌发率。

2 结果与分析

2.1 罗汉果柱头可授性

2.1.1 联苯胺—过氧化氢法 联苯胺过氧化氢法浸没柱头后，发现柱头表面变成蓝色，气泡产生不明显。可能是因为联苯胺溶解差，气泡多寡的统计观察因人而异。此法用于测定罗汉果柱头可授性的重复性差。

2.1.2 MTT（噻唑蓝）染色法 将当天上午新鲜柱头、当天下午新鲜柱头、第二天上午的柱头、第二天下午的柱头分别于当天上午、当天下午、第二天上午、第二天下午浸泡在MTT染色液内，观察柱头染色的颜色、染色所需时间，比较它们的柱头活力，判断柱头可授性。

从表1可以看到，越新鲜的柱头，染色所需时间短，蓝黑色染色越深；越不新鲜的柱头，染色需要的时间越长，染色颜色越浅（见图1、2）。

从MTT染色法来看，柱头可授性随开花时间推移变弱，与田间授粉结实情况相符合。柱头可授性随开花时间推移变弱，开花后第二天下午仍有活性，但活性变弱。同时，柱头活力还受植株情况、天气情况、植株挂果情况的影响。

2.2 罗汉果花粉活力测定

2.2.1 三种测定方法结果

（1）醋酸洋红染色法。染色液与花粉在显微镜下，全部显示出红色，花粉染色与未染色无区别（如图3所示）。不论新鲜花粉还是保存了一年的旧花粉，滴加染色液后视野内都是红色。

（2）TTC染色法。滴入染色液后，经过1h、2h，甚至第二天肉眼观察，染色液仍然呈无色，花粉也没有变成红色。在黄色光源显微镜下观察，花粉没有变成红色（见图4）。不论新鲜花粉还是保存了一年的旧花粉，滴加染色液后视野内的花粉没有变色。

（3）离体萌发法。花粉培养溶液30min后开始萌发花粉管，花粉伸长正常，不破裂，视野干净清晰，容易计数（见图5，表2）。

（4）方法比较。醋酸洋红染色法不管花粉有无生活力，只要花粉内还存在脱氢辅酶存在，都会染上红色。另外，此法染色花粉与未染色花粉的区别不大，不适用于罗汉果花粉活力测定。

TTC染色法染色时间过长、染色效果不佳，甚至没有染色，且TTC染色液有毒，也不适用于罗汉果花粉活力测定。

花粉离体萌发法，虽然操作复杂，花粉不易涂抹均匀，统计耗时长，但其测定的数据科学可靠，并可完全定量，是罗汉果花粉生活力测定的首选方法。

2.2.2 离体萌发法检测保存花粉的活力 采用萌发法测定经低温冷藏后的罗汉果花粉活力，见表3。

采用离体萌发法检测低温贮藏花粉的活力，具有数据可靠，可以准确定量罗汉果雄花用量优点，效果很好。从表3可以看出，罗汉果雄花经低温保存后，第二天仍能保持相当高的活力。花粉活力从第3d下午开始下降，第4d下午下降最快。表明罗汉果花粉经低温冷藏保存，至第4d仍具有生产使用意义。

3 结论与讨论

3.1 关于柱头可授性

检测罗汉果柱头可授性，两种方法各有优缺点：联苯胺过氧化氢法是多种植物检测柱头可授性的最常用方法，不过联苯胺溶解性非常差，药水配制比较麻烦，气泡多寡的计数会因人而异，重复性比较差；MTT法染色明显，肉眼可以观察，染色时间可以确定，简单快捷，适用于罗汉果柱头可授性的检测。

3.2 关于花粉活力测定

采用的花粉离体培养液，培养离体花粉的最高萌发率可达90%甚至更高，接近生产实际的人工点花平均结实率[3]，表明该培养液测定罗汉果花粉活力科学、有效，是测定罗汉果花粉活力的最适合方法。

参考文献：

[1] Dafni A，Maués M M.A rapid and simple procedure to determine stigma receptivity.Sexual Plant Reproduction，1998，11：177-180.

[2] 张妍，杨发君，田义新.穿龙薯蓣花粉活力及柱头可授性测定方法研究[J].安徽农业科学，2010，38（5）：2344-2346.

[3] 广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所.罗汉果栽培与化学研究[M].南宁：广西科学技术出版社，2005.