北京市养殖鱼类主要病原菌及其药物药敏性

文/王小亮　徐立蒲　张文　王澎　曹欢　王姝　王静波



北京市养殖鱼类主要病原菌及其药物药敏性

文/王小亮徐立蒲张文王澎曹欢王姝王静波

由于水产养殖环境恶化，各种水产病害频发，特别是细菌性疾病更为严重，已给养殖业造成重大经济损失。为此，本文针对北京地区开展养殖鱼类常见病原菌调查，并进行鱼类病原菌药物敏感性的监测，了解其耐药现状，构建药物敏感谱并不断更新，筛选出有效防治药物，指导养殖户科学合理使用抗菌药物。

一、材料和方法

（一）试验材料

1.样品来源

北京市发病的养殖鱼类，包括鲤、锦鲤、鲫、金鱼、草鱼、鲟、虹鳟。

2.仪器

超低温冰箱（MDF-382，日本SANYO公司），生化培养箱（LRH-150B,上海一恒公司）、细菌浊度计（WGZ-2-X，上海昕瑞仪器仪表有限公司）、PCR仪（Mastercycle Gradient，德国Eppendorf公司）、电泳仪（DYY-6C，北京六一仪器厂）、凝胶成像系统（IS-3400，Alpha Innotech 公司）。

营养琼脂、大豆酪蛋白琼脂、Mulluer-Hinton肉汤（MHB）、Mulluer-Hinton琼脂（MHA）、寡营养琼脂、脑心浸液肉汤培养基（BHI）和脑心浸液琼脂（BHIA）购于北京陆桥技术有限责任公司，血琼脂购于北京威泰科生物技术有限公司，药敏纸片购于杭州诺森德生物技术公司，抗菌药物购于美国Sigma公司。

（二）试验方法

1.病原菌分离方法

将病鱼置于灭菌解剖盘中，用75%酒精棉球擦拭鱼体。如果鱼体表有红肿、溃疡等病灶，用75%酒精棉球蘸擦病灶，然后用灭菌解剖刀沿病灶边缘靠近新鲜组织约1mm处切开，切面即为取样部位。如鱼体表无异常，用灭菌剪刀在肛门前约5mm处横向剪透腹腔，然后从开口处向上沿测线下缘剪至鳃盖下缘，再向下剪，过腹部至另一侧的鳃盖下缘，将剪开的一侧翻开，露出内脏。剪切过程中，剪刀头向外，防止剪破组织，尤其肠道，避免杂菌污染。

2.病原菌鉴定方法

病原菌鉴定主要采用API 鉴定系统，辅助采用PCR鉴定方法。

3.药物敏感性检测方法

（1）纸片扩散法

药敏检测借鉴美国临床实验室标准委员会制定的《抗微生物药物敏感性试验执行标准（2010年）》，采用其中的纸片扩散法（定性法）。修改或自定了部分参数：培养温度调整为28℃，抗菌药物调整为国家许可的水产养殖上使用的抗菌药物；依同类药物的敏感线，自定标准内没有的抗菌药物的敏感线。

（2）药物敏感性检测的浓度梯度稀释法

药敏检测借鉴美国临床实验室标准委员会制定的《抗微生物药物敏感性试验执行标准（2010年）》，采用其中的浓度梯度稀释法（定量法），修改或自定了部分参数，如培养温度调整为28℃，抗菌药物调整为国家许可的水产养殖上使用的抗菌药物；依同类药物的敏感线，自定标准内没有的抗菌药物的敏感线。

结果记录为将加菌的药物浓度梯度管与对应的未加菌的药物浓度梯度管比较，肉眼观察试管中培养基变浑浊，即为未抑制菌生长，反之，为抑制菌生长。将抑制菌生长的试管中药物浓度最低的值最为最小抑菌浓度（MIC），记录为该药物抑制检测菌的MIC值。其它菌和其它抗菌药物的监测方法类同。

数据统计方法是纸片扩散法敏感率＝（敏感的菌株数÷总检测菌株数）×100%，浓度梯度稀释法的敏感率＝（不高于耐药MIC值的菌株数÷总检测菌株数）×100%，按表1界定敏感或耐药，加权平均MIC＝∑（菌株数×对应的MIC值）/菌株总数。

表1　浓度梯度法使用的抗菌药物及界定的敏感线

二、结果

1.病原菌种类及组成

2014年共从北京地区发病的养殖鱼类体内分离出病原菌143株，134株鉴定出种类，隶属于16个种（属）。病原菌中以气单胞菌属菌最多，占66.42%，遍及所有区县的所有养殖鱼类；其次是类志贺邻单胞菌、链球菌、霍乱弧菌、不动杆菌和腐败希瓦氏菌，主要来源于鲟鱼和金鱼。详见表2。

2.病原菌药物敏感性情况

（1）病原菌耐药性总体特征

采用纸片扩散法检测的病原菌药物敏感性结果：总体上，北京市养殖鱼类病原菌对氟喹诺酮类药物（恩诺沙星）和强力霉素的敏感率在90%左右，对氟苯尼考和四环素的敏感率在80%上下，对两种磺胺类药物（磺胺异恶唑和甲氧苄啶）的敏感率在25%附近。从病原菌的来源养殖对象看，不同养殖对象的病原菌对抗菌药物的敏感性有所不同，如冷水鱼病原菌对强力霉素最为敏感，随后是嗯诺沙星和氟苯尼考，而温和食用鱼和观赏鱼的病原菌最敏感药物为嗯诺沙星，随后是氟苯尼考和强力霉素。

浓度梯度稀释法检测的病原菌药物敏感性结果：总体上，单独使用的磺胺类药物（磺胺甲恶唑、磺胺间甲氧苄啶、磺胺嘧啶和磺胺二甲氧苄啶）对所有病原菌菌株的最小抑菌浓度（MIC）均超过512g/mL，即磺胺类药物的体外杀菌效果极差，以下将不再叙述。80%以上的分离株对恩诺沙星、盐酸多西环素、氟苯尼考和盐酸四环素敏感，加权平均MIC分别为3.02g/mL、4.43g/mL、17.52g/mL和13.66g/mL；70%以上的分离株对甲砜霉素敏感，加权平均MIC为34.83g/ mL；土霉素和硫酸新霉素在耐药浓度线以下对分离菌株的敏感率较低，分别为65.29%和27.27%，加权平均MIC为33.77g/mL和15.71g/mL。不同药物对病原菌菌株的MIC分布情况及分离菌株的敏感率见表3。

（2）不同病原菌种类的药物敏感性

嗜水气单胞菌对恩诺沙星、强力霉素和氟苯尼考的敏感率较高，均超过80%，温和气单胞菌对除磺胺类药物外的其它试验药物的敏感率均在80%以上，杀鲑气单胞菌对除甲氧苄啶外所有抗菌药物敏感率均在80%以上。类志贺邻单胞菌无特别敏感药物。弧菌对四环素、强力霉素、氟苯尼考和恩诺沙星的敏感率较高，均超过80%。

表2　北京地区主要养殖鱼类病原菌（2014年）

表3　不同抗菌药物对鱼类病原菌的最小抑菌浓度分布（n＝121）

从药物的敏感浓度看，嗜水气单胞菌的较敏感药物为恩诺沙星、氟苯尼考和盐酸多西环素，加权平均MIC分别为6.65g/mL、26.53g/mL和5.08g/ mL。温和气单胞菌对除硫酸新霉素外的其它检测药物均较敏感，敏感率都在78%以上，加权平均MIC最低的是嗯诺沙星和盐酸多西环素，分别为1.59g/mL和2.73g/mL。杀鲑气单胞菌的较敏感药物为嗯诺沙星、盐酸多西环素、盐酸四环素和氟苯尼考，对应的加权平均MIC依次为0.67g/mL、1.88g/mL、2.88g/mL和22.46g/mL。其它病原菌的较敏感药物为恩诺沙星、盐酸多西环素、盐酸四环素和氟苯尼考，敏感率均在70%以上，对应的加权MIC依次为2.45g/mL、6.54g/mL、14.11g/mL和21.21g/mL。

（3）病原菌药敏情况的年变化

病原菌对抗菌药物的敏感率近三年（2012～2014）呈现先降低后升高的趋势，但年份之间的差异性不显著（P＞0.05）。抗菌药物对病原菌的加权平均MIC呈现先升高后降低的趋势，年份之间差异也不显著（P＞0.05），见表4。病原菌的敏感情况随年份的变化受到药物使用、病原菌的取样、科学指导用药等方面的综合影响，因此，需要连年检测才可能确定出年份变化的影响因子和规律。

三、讨论

1.养殖鱼类的病原菌

北京市养殖鱼类的主要病原菌种类是气单胞菌属的嗜水气单胞菌和温和气单胞菌，占病原菌种类总数的53.8%。这两种病原菌遍及北京市所有区县，流行温度为12℃～29℃，对养殖生产造成严重危害。

表4　不同年份鱼类病原菌对抗菌药物的敏感情况

鲟鱼体内分离到的无乳链球菌、微杆菌、假单胞菌、巴斯德菌等都为北京地区新检出的病原菌。杀鲑气单胞菌是鲑鳟鱼体内分离到的常见病原菌，此外首次在鲑鳟鱼体内分离到鲑肾杆菌。鲑肾杆菌为国外流行的致病菌，推测该菌是随引种传入我国，并在北京首次发现，因此必须加强引种检疫工作。

上述病原菌均为养殖水环境中存在的菌群，由于管理和水质环境恶化而导致鱼体免疫力下降是造成细菌病发生的主要原因之一。因此，控制此类病应主要从以下方面采取措施，一是加强放养和投喂管理，提高鱼体抗病能力；二是优化养殖水环境，降低养殖鱼类应激；三是适当使用免疫增强剂、中草药等提高鱼体非特异性免疫能力。

2.养殖鱼类的病原菌药敏特点

总体上，北京市养殖鱼类的病原菌敏感药物种类与往年相似，为恩诺沙星、盐酸多西环素、盐酸四环素和氟苯尼考。利用北京市养殖鱼类病原菌的敏感药物的共性，制定了北京市养殖鱼类病原菌敏感药物谱（2014年），见表5。可用于无法及时送样检测的养殖户选择药物，大幅提高有效用药的概率。

表5　北京市养殖鱼类病原菌敏感药物谱（2014年）

北京市养殖鱼类的病原菌呈现不同种属、不同菌株、不同养殖鱼类来源之间，对抗菌药物的敏感性不同。也就是不同渔场分离的病原菌药物敏感性不同、同一渔场分离的不同种属的病原菌药物敏感性不同、同一渔场不同时间分离的同种病原菌药物敏感性也不同。原因可能是北京市鱼类养殖场的离散状分布和养殖者使用抗菌药物的随机性。鉴于上述特点，今后指导科学合理使用抗菌药物需要加强两个方面工作：一是净化假劣抗菌渔药；二是加快病原菌药物敏感性的快检技术研发和应用，尽可能普及到每个养殖场。

作者单位：北京市水产技术推广站