木质素过氧化物酶降解四环素机理的研究

李星星，鲍建国，冷一非，刘 颖，郭 慧，郑 进

(1．中国地质大学(武汉)环境学院，湖北武汉430074; 2．湖北理工学院环境科学与工程学院，湖北黄石435003)

木质素过氧化物酶降解四环素机理的研究

李星星1，2，鲍建国1，冷一非1，刘 颖1，2，郭 慧1，郑 进2

(1．中国地质大学(武汉)环境学院，湖北武汉430074; 2．湖北理工学院环境科学与工程学院，湖北黄石435003)

为探究过氧化物酶对四环素类抗生素的降解机理，以白腐真菌Phanerochaete chrysosporium表达的木质素过氧化物酶(LiP)粗酶为研究对象，研究其产酶条件及其降解四环素(TC)的机理。结果表明:低浓度Mn2+可促进产酶，碳源、氮源限制是产酶的重要条件;降解反应进行10 min后，H2O2消耗至阈值0．045 mmol/L，LiP对TC的降解停止，其降解率达到82%;TC降解反应趋于平衡时，补加TC和H2O2后，LiP依然可以高效发挥作用，其二次降解率达到65%;LiP作用于不同初始浓度(10 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L)TC，显示LiP对不同浓度TC均可有效降解，TC降解率分别为62%、80%、82%和90%;降解产物的抑菌性试验反映出降解产物较TC母体的抑菌性明显降低;LC/MS捕获到6种可能的降解产物E-TC、TP 461、E-TP 461、TP 477、TP 475和TP 445，并推测出LiP降解TC可能的降解途径。

四环素(TC);木质素过氧化物酶(LiP);抑菌性;降解产物;降解机理

四环素类(Tetracyclines，TCs)抗生素是由放线菌产生的一类广谱抗生素，其价格低廉，是目前世界上使用最广泛、用量最大的抗生素种类之一［1］。

在过去数十年中，四环素类抗生素作为人、兽用药和饲料添加剂被大量使用，这也导致了环境污染化合物的增加［2-3］。由于它们可能和微生物的抗生素抗性有潜在的联系，其在环境中的残留受到了广泛的关注［4］。四环素在使用后，一部分被人体或动物体代谢为低活性的化合物，另一部分约30%～90%以原药形式或是活性代谢产物的形式由尿液、排泄物、粪便的形式释放到环境中(地表水、地下水、土壤)［5］。此外，环境中四环素类抗生素的生态风险和潜在毒性的问题也同样引起研究者的关注［6］，环境中残留的四环素会导致微生物多样性的下降，促进了抗生素抗性微生物的发展和演化，对人类饮用水和灌溉用水造成潜在的威胁，同时也会引起人类肠道菌群的紊乱，增加感染风险，从而影响人类的健康［7］。

针对环境中四环素污染问题的研究主要集中在其环境地球化学行为、生物堆肥和活性污泥中的降解效率、光催化以及高级氧化等物理和化学技术的研究方面［8］，而四环素的生物降解、酶降解的研究则较为薄弱。目前越来越多的研究表明生物酶能用于许多特殊污染物的降解，随着生物科学技术的发展，更多廉价高效的酶被分离纯化并应用于特殊污染物的处理中。较传统的处理技术而言，生物酶处理技术有着诸多的潜在优势，如可用于难降解有机物的降解，能较好地作用于高浓度或低浓度污染物，反应条件温和等［9］。近些年来，过氧化物酶受到研究者的广泛关注，它是由微生物或植物所产生的一类氧化还原酶，通过催化过氧化氢或低分子量有机过氧化物与有机化合物的氧化反应，达到降解有机污染物的目的，如Cooper等［10］发现辣根过氧化物酶能有效降解苯酚; Bhunia等［11］发现过氧化物酶对染料有降解效果。除此之外，过氧化物酶对硝基苯、氯酚、萘酚、多环芳烃等有机污染物降解的可行性也都有报道［12］，如清华大学文湘华教授的研究团队论证了由白腐真菌产生的两种过氧化物酶(木质素降解酶和锰过氧化物酶)对四环素的降解可行性［13］。而目前过氧化物酶在四环素类抗生素污染的降解机理却少有报道。为此，本文以木质素过氧化物酶(LiP)为代表，研究其产酶条件、对四环素的酶促降解条件、解毒效果、降解产物的捕获以及可能降解途径的推断等，为木质素过氧化物酶在四环素类抗生素污染的环境治理提供依据。

1 材料与方法

1．1 化学药品

四环素(TC)、Tween80、甲醇(色谱纯)和乙腈(色谱纯)购自上海Aladdin公司;藜芦醇购自上海源叶生物科技有限公司;其余药品均为分析纯试剂。

1．2 菌种及其培养条件

1．2．1 菌种

白腐真菌Phanerochaete chrysosporiumBKM-F-1767购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。

1．2．2 培养基

固体培养基:PDA培养基，马铃薯浸出液200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，pH值自然。

液体产酶培养基:基于Tien和Kirk的基础培养基［14］，以0．2 mol/L酒石酸-酒石酸钠缓冲液(pH值为4．4)替代琥珀酸二甲酯缓冲溶液，培养基中引入1．5 mmol/L藜芦醇、1．0 g/L Tween80和0．2 g/L酵母粉，以葡萄糖、酒石酸铵为碳源、氮源。

1．3 试验方法

1．3．1P．chrysosporium选择性产LiP的条件

将P．chrysosporium由冻干管接种至PDA固体培养基，37℃培养7～9 d，用无菌水洗涤得到孢子悬液备用。在装液量为100 mL/250 mL的产酶培养基中加入孢子悬液，控制孢子浓度为1×105个/mL，于37℃、120 r/min恒温摇床内培养。

碳源、氮源和Mn2+浓度是影响产LiP的重要因素［15-16］，选取葡萄糖、酒石酸铵和 MnSO4为产 LiP的限制因子，每个因子设定两个水平，共8组组合(见表1)产LiP，选取酶活较高且不产生P．chrysosporium所产的其他酶——锰过氧化物酶和漆酶的组合为选择性产LiP的条件。在该培养条件下测得酶活高峰时收获酶液，将培养基于10 000 r/min、4℃离心10 min，上清液即为粗酶液，在冰箱内4℃保存备用，酶活可保持3个月以上。

表1 产木质素过氧化物酶因子水平表Table 1 Combinations of factors and levels for LiP production

1．3．2 LiP对TC的降解

LiP降解TC体系见表2。以加入高温失活酶为空白对照，降解反应在37℃恒温摇床内进行，摇床转速为120 r/min，反应过程避光，所有样品均设置3个平行样。通过向样品中1∶1(V/V)加入二氯甲烷并剧烈振荡终止酶反应，8 000 r/min、4℃离心3 min，上清液经0．22 μm微孔滤膜过滤，由高效液相色谱法和钛盐分光光度法分别测定TC降解过程中TC和过氧化氢(H2O2)的浓度变化。降解反应进行10 min后向反应体系补加初始浓度H2O2，测定降解过程中TC的浓度变化;降解反应进行1 h后向反应体系同时补加TC和H2O2，补加量与初始加入量相同，测定降解反应过程中TC和H2O2的浓度变化。TC降解率的计算公式为

式中:D为TC的降解率(%);C0为空白对照样中TC浓度(mg/L);Cx为样品中TC残留浓度(mg/L)。

表2 LiP降解四环素体系Table 2 Composition of TC degradation system by LiP

1．3．3 LiP降解TC产物的抑菌性

TC及其降解产物的抑菌活性通过牛津杯法进行测定［17］。大肠杆菌在液体营养培养基中37℃振荡培养至对数生长期收集菌体，用生理盐水调节OD600= 1．0，备用。将牛津杯置于含大肠杆菌的营养琼脂平板上，分别加入300 μL待测样品，将平板转移至30℃培养箱培养16～18 h后测定抑菌圈直径。

1．4 分析方法

(1)LiP酶活测定:采用Tien和Kirk方法［14］，定义每1 min氧化1 μmol藜芦醇成藜芦醛所需的酶量为1个酶活力单位。

(2)锰过氧化物(MnP)酶活测定:采用Paszczynski方法［18］，定义每1 min氧化1 μmol Mn2+为Mn3+所需的酶量为1个酶活力单位。

(3)H2O2浓度测定:采用钛盐分光光度法［19-20］。

1．5 TC浓度测定

TC浓度采用HPLC(Shimadzu LC-06A)进行分析，色谱柱采用C18反相柱(4．6 mm×250 mm，5 μm，Agilent)。色谱分析条件:流动相为67%的0．1M甲酸溶液、22%乙腈和11%甲醇，流速为1 mL/min，柱温为40℃，进样量为20 μL，检测波长为355 nm。

1．6 LiP降解TC产物的LC/MS检测

取LiP降解四环素体系0 min和10 min的样品，经固相萃取柱(Oasis HLB，6cc/150 mg，Waters)萃取后备用［21］，采用液相质谱联用仪(Q Exactive system，Thermo scientific，USA)分析TC的降解产物。色谱分离柱采用C18反相柱(4．6 mm×150 mm，3 μm，Phenomenex)，流动相为67%的0．1 M甲酸溶液、22%乙腈和11%甲醇，流速为0．5 mL/min，进样量为5 μL;质谱使用电喷雾解离源、正离子模式。数据采集使用质荷比(m/z)范围为200～600下的全扫描模式。

2 结果与分析

2．1 P．chrysosporium选择性产LiP的条件

试验选取对P．chrysosporium产LiP影响较大的限制因子，即碳源(C)、氮源(N)、Mn2+浓度为主要因子，测定3种因子不同组合情况下对P．chrysosporium产LiP的影响，其试验结果见图1。

由图1可见，LiP在第5 d出现酶活，6～7 d达到酶活高峰，在低Mn2+浓度条件下有较高的酶活表现，除高碳高氮低锰条件外，其他低Mn2+浓度条件峰值均大于100 U/L;在低碳低氮低锰条件下LiP酶活表现最好，峰值为138 U/L，其次为高碳低氮低锰条件下LiP酶活峰值为130 U/L，而在这两种条件下P．chrysosporium所产的另一种酶——锰过氧化物酶也有一定的酶活表现(结果未给出);在低碳高氮低锰条件下检测到较高的LiP酶活，其峰值为120 U/ L，而P．chrysosporium所产的其他酶——锰过氧化物酶和漆酶的酶活均未被检出(结果未给出)，该条件下第6 d LiP酶活高峰期收获酶液即为LiP粗酶液。

图1 不同限制因子对P．chrysosporium选择性产LiP的影响Fig．1 Effects of different limiting factors on LiP production byP．chrysosporium

2．2 LiP对TC的降解

2．2．1 LiP降解TC过程中H2O2浓度的变化

LiP对TC的降解及反应过程中H2O2浓度的变化见图2。由图2可见，TC在前10 min内被快速降解转化，其降解率达到82%，之后趋于稳定;同时在前10 min内，随着TC的快速降解，H2O2不断消耗，其由初始的0．4 mmol/L迅速降低至0．045 mmol/L;当H2O2的残留浓度降低至约0．045 mmol/L时趋于稳定，此时TC的降解率也无明显变化。

图2 LiP降解TC过程中H2O2浓度的变化Fig．2 Concentration variation of H2O2during TC degradation by LiP

2．2．2 补加H2O2和TC对LiP降解TC的影响

2．2．2．1 补加H2O2

试验在LiP降解TC反应进行10 min后向体系中补加初始加入量的H2O2，其试验结果见图3。由图3可见，补加H2O后，TC降解率从80%提升至92%。

图3 补加H2O2对LiP降解TC的影响Fig．3 Effects of H2O2addition on TC degradation by Lip

2．2．2．2 补加H2O2和TC

试验在LiP降解TC反应进行1 h后向体系中同时补加初始加入量的H2O2和TC，其试验结果见图4，降解反应过程中空白对照TC基本未消耗(结果未给出)。由图4可见:随着H2O2的消耗，TC浓度降低;补加10 min后，H2O2浓度从补加时的0．45 mmol/L降至0．13 mmol/L，TC浓度从补加时的60 mg/L降至25 mg/L，TC的降解率为58%;补加1 h后，H2O2浓度降至0．045 mmol/L，TC浓度降至20 mg/L，TC的降解率为65%。

图4 补加H2O2和TC对LiP降解TC的影响Fig．4 Effects of H2O2and TC addition on TC degradation by Lip

2．2．3 LiP对不同初始浓度TC的降解效果

图5 不同初始浓度TC下LiP对TC的降解效果Fig．5 Degradation of TC with different initial concentrations of TC by LiP

试验中LiP降解TC体系的其他条件不变，作用于不同初始浓度TC，考察不同初始浓度TC对LiP降解TC的影响，其试验结果见图5，反应过程中空白对照TC基本未消耗(结果未给出)。由图5可见:补加H2O2和TC前，LiP对试验浓度范围内(10～100 mg/L)TC的降解呈现出随着TC初始浓度的增加，TC降解率呈上升的趋势，即初始浓度为100 mg/L时TC降解率达90%，TC初始浓度为50 mg/L时TC降解率达82%，TC初始浓度为25 mg/L时TC降解率达80%，TC初始浓度为10 mg/L时TC降解率为62%;补加H2O2和TC后，TC初始浓度为100 mg/L的样品中TC浓度从109．9 mg/L降至27．9 mg/L，其降解率为75%，TC初始浓度为50 mg/L的样品中TC浓度从56．7 mg/L降至17．1 mg/L，其降解率为69．8%，TC初始浓度为25 mg/L的样品中TC浓度从28．0 mg/L降至5．0 mg/L，其降解率为82%，TC初始浓度为10 mg/L的样品中TC浓度从14．8 mg/L降至4．1 mg/L，其降解率为72%。

2．3 降解产物的鉴定

2．3．1 LiP降解TC产物的抑菌性

对LiP降解不同初始浓度(10 mg/L、25 mg/L、50mg/L、100 mg/L)TC以及不同降解时间的样品进行大肠杆菌的抑菌性试验，其试验结果见图6。由图6可见，随着降解反应的进行，抑菌圈直径减小，其中TC初始浓度为50 mg/L时抑菌圈直径减小最为明显，从21．32 mm减小至9．58 mm;TC初始浓度为10 mg/L时抑菌圈直径变化不大，从11．94 mm减小至8．88 mm。

2．3．2 LiP降解TC的产物鉴定

对LiP降解TC 0 min和10 min的样品进行降解产物检测(酶降解体系参照表2)，6种可能的降解产物被捕获，其质荷比、预测分子量、实测分子量、保留时间等见图7和表3。TC母体化合物的m/z为445．160 3，保留时间为4．96 min，具有同样质荷比且保留时间提前(4．42 min)的峰为TC差向异构体E-TC。

图6 LiP降解TC产物的抑菌性Fig．6 Antibacterial potency of the degradation products of TC by LiP

图7 LiP降解TC产物(m/z461、m/z477、m/z475、m/z445)提取离子流质谱图Fig．7 Extracted ion chromatograms of the degradation products by LiP atm/z461(a)，m/z477(b)，m/z475(c)andm/z445(d)

表3 TC及其降解产物的色谱特征Table 3 Characteristics of the parent compound and the degradation products from TC

图8 LiP降解TC的可能途径Fig．8 Proposed pathway of TC degradation by LiP

LiP对TC降解的可能途径见图8。由图8可见，TC母体在 C11a加氧发生羟基化反应得到TP461，进一步在C2加氧形成TP477;在C6发生脱水反应、C9发生羟基化反应后形成TP475;最后通过D环C9和C10羟基的氧化和A环C1的脱羰作用形成最终产物TP445。

3 讨 论

Mn2+对P．chrysosporium产LiP有显著的影响，高浓度Mn2+抑制白腐真菌产酶，而低浓度Mn2+能促进LiP的产生。李华钟等［16］研究表明，适量的Mn2+存在时菌丝球表面形成的褐色沉淀物MnO2可保护LiP不受菌丝产生的H2O2毒害，从而提高LiP的酶活，而在高Mn2+浓度条件下，培养液中产生的过量Mn3+抑制了MnO2的生成，产LiP受阻。低Mn2+浓度时，碳源或氮源限制条件下均能检测到较高的LiP酶活，而在碳源、氮源充足的条件下LiP酶活较低(见图1)，说明限碳或限氮是产酶的重要条件［22］，但Lip表达调控机制复杂，受碳、氮调节机制并非固定不变的，在一定情况受培养条件影响，不同的情况最佳碳、氮素含量有所不同［23］。

H2O2浓度是LiP降解TC的关键因素，酶降解反应通过H2O2触发，但过量H2O2会导致LiP失去活性［24］。降解反应体系中需加入适量浓度H2O2，以促使TC降解反应的进行，当H2O2消耗至阈值时(0．045 mmol/L)，额外补加H2O2可以重新启动降解反应，提高TC的降解率。TC降解反应进行1 h后重新补加H2O2和TC，LiP仍有较强的TC降解效果，5 h后LiP酶活仍稳定在40 U/L，10 h后体系内出现沉淀，LiP酶活降为0 U/L(结果未给出)，此现象表明LiP具有一定的持效性，在一定条件下可以重复利用。

LiP降解TC反应趋于平衡后补加初始加入量的H2O2和TC，初始浓度为10 mg/L、25 mg/L的TC二次降解率高于初次降解率，这主要是因为补加TC和H2O2后TC浓度分别升高至14．8 mg/L和28．0 mg/L;而初始浓度为50 mg/L、100 mg/L的TC二次降解率低于初次降解率，表明LiP虽然具有一定的持效性，但对较高浓度的TC，重复利用降解率下降明显。

Jiao等［25］、Guo等［26］的研究发现，TC的光降解产物毒性比母体化合物毒性更强。而在本研究中，LiP对不同浓度TC降解后产物的抑菌性降低。同样，在Suda等［27］的研究中，由白腐真菌所产的多酚氧化酶——漆酶降解TC后产物毒性也有所降低，生物酶降解TC过程中不会产生更强毒性的降解产物，较TC的传统处理方法有相当的优势。

TC母体在酸性(pH=3～6．5)条件下，一部分易转化为其差向异构体E-TC［28］，E-TC在C11a加氧得到E-TP 461。Dalmázio等［29］和Wan等［30］在臭氧处理TC的研究中同样检出TP461和TP477，pH值较低时，邻位供电子官能团的存在使得 TC的C11a-C12双键成为最具活性的反应位点，在该位点发生1，3-偶极加成反应形成TP 461，具有较低电子密度的C2-C3活性位点发生同样的氧化反应得到TP 477。Vartanian等［31］，Kamel等［32］的研究表明，C6的羟基易发生脱水反应形成更稳定的苯环结构，形成可能的中间产物(m/z为459)。C10的苯酚结构使得邻位C9易发生加氧羟基化反应，经过C9的羟基化作用形成的邻苯二酚结构并通过两电子氧化形成苯氧结构［33］，得到TP473。由于C1-C12a键能较C1-C2低，α-断裂在C12a-C1发生，随后产生一种双自由基中间体，通过羰基的脱去形成另一中间体，这一中间体的C12a与C2连接后形成闭环结构［34］，转化为最终产物TP 445。

4 结 论

(1)研究了不同限制因子对白腐真菌产LiP的影响，并确定了白腐真菌选择性产LiP的条件，低浓度Mn2+、限碳或限氮有利于产酶，选择性产LiP条件为低碳高氮低锰。

(2)H2O2的浓度是LiP降解TC反应的关键因素，通过补加适量的H2O2可以提高TC的降解率。反应过程中LiP的损失较小，再重新补充 TC和H2O2后，也有相当的TC降解效果，为LiP在实践中的重复利用打下理论基础。

(3)LiP对不同初始浓度(10 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L)TC均可有效降解。

(4)LiP降解TC的降解产物较TC母体的抑菌性明显降低。

(5)检测出6种可能的TC降解产物，分别为E-TC、TP 461、E-TP 461、TP 477、TP 475和TP 445，并推测了其降解途径。

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Degradation Mechanism of Tetracycline by Lignin Peroxidase

LI Xingxing1，2，BAO Jianguo1，LENG Yifei1，LIU Ying1，2，GUO Hui1，ZHENG Jin2
(1．School of Environmental Studies，China University of Geosciences，Wuhan430074，China;2．School of Environmental Science and Engineering，Hubei Polytechnic University，Huangshi435003，China)

To study the mechanism of tetracycline antibiotics degradation by peroxidase，this paper chooses the crude enzyme of lignin peroxidase(LiP)from Phanerochaete chrysosporium as the research object，and explores the induction conditions of lignin peroxidase and degradation mechanism of tetracycline(TC)．The results indicate that the limitation of carbon，nitrogen and low concertation of Mn2+are important factors for enzyme production．The degradation reaction of TC terminates when the concentration of H2O2decreases to 0．045 mmol/L，and the degradation rate reaches 82%within 10 min．LiP is still effective by adding TC and H2O2when degradation reaction reaches balance，and the secondary degradation rate is 65%．Lignin peroxidase has a strong ability of TC degradation with different initial concentrations(10 mg/L，25 mg/L，50 mg/L，100 mg/L)，the degradation rate being 62%，80%，82%and 90%respectively．According to oxford cup tests，the transformation products of TC show lower antimicrobial potencies than the parent compound．There are six possible transformation products，namely，E-TC，TP 461，E-TP 461，TP 477，TP 475 and TP 445 using LC/MS in the progress of TC degradation by LiP．Besides，the paper infers the potential degradation pathway of TC by LiP．

tetracycline(TC);Lignin peroxidase(LiP);antimicrobial potency;degradation product;degradation mechanism

X52;X172

ADOI:10．13578/j．cnki．issn．1671-1556．2016．05．010

1671-1556(2016)05-0061-08

鲍建国(1963—)，男，博士，教授，主要从事水污染控制、土壤修复、清洁生产等方面的研究。E-mail:bjianguo@cug．edu．cn

2016-04-13

2016-06-22

国家自然科学基金项目(4137308)

李星星(1991—)，女，硕士研究生，主要研究方向为水污染控制与环境影响评价。E-mail:602307110@qq．com